196228. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az L 17046 antibiotikum észter származékainak és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196228 2 biotikum karboxil-csoportja „aktiválásával” kapcsolatban említettek tekinthetők. A karboxilcsoport aktiválószereként az ismert karbodiimid származékon kívül a tioniiklorid is alkalmazható. Ez az aktiválószer különösen előnyösen alkalmazható (I) általános képletű halo-(l—12 szénatomos)-alkilészterek előállítására. Egyes klór-alkilészterek — például a 4-klór-butilészter — úgy is előállíthatók, hogy az L 17046 antibiotikumot oxetánnal, tetrahidrofuránnal, tetrahidropiránnal, oxepánnal, 2-metil-tetrahidrofuránnal, 3-metil-tetrahidrofuránnal, illetőleg 3- -metil-tetrahidropiránnal reagáltatjuk, sósav átbuborékoltatása közben. A reakció hőmérséklete előnyösen 30 °C—60 °C. A reakció általában 4—24 óra alatt befejeződik. A szakember számára magától értetődő, hogy az előbbiekben ismertetett észterezési eljárásban a reakcióidő változik a konkrét reakciókörülmények és az alkalmazott kiindulási anyagok függvényében. Mivel azonban a találmány szerinti vegyületek éppúgy, mint a teikoplaninszerű kiindulási anyagok autobiográfiás vizsgálatokkal könnyen kimutathatók, ill. TLC vagy HPLC segítségével megfigyelhetők, a szakember ugyancsak képes a reakció lefolyásának követésére és annak meghatározására, hogy a reakció mikor fejeződik be. A következőkben egy példát írunk le arra, hogy a reakció lefolyása hogyan követhető HPLC-vel. A reakcióelegyből meghatározott időközönként kb. 20 pl-es mintákat veszünk, a mintákat 50:50 (térf./térf.) 0,2 %-os vizes ammóniumformiát: acetonitril elegy hozzáadásával kb. 2 mg/ml végkoncentrációra hígítjuk és beinjektáljuk a HPLC rendszerbe. A HPLC rendszer egy Varian 5000 kromatográf, Rheodyne 7125 típusú 20 jui-es injektor-kaccsal ellátva. A rendszer további részei: egy 254 nm-es UV detektor és egy Perisorb RP-8 Merck töltettel megtöltött elő-oszlop (30—40 nm), amelyet egy LiChrosorb RP-8-cal (10 fim) elő-töltött Hibar Merck oszlop (25 cm) követ. Eluálószer: lineáris grádiens 15 % B-től (A-ban) 32 % B-ig (A-ban) 20 perc alatt, kb. 2 inl/perc áramlási sebesség mellett; A oldószer: 0,2 %-os vizes ammóniumformiát B oldószer: acetonitril. Néhány találmány szerinti jellegzetes vegyület relatív retenciós idejét az előbbi rendszerben az I/a táblázatban mutatjuk be. A következőkben egy másik példát mutatunk be a HPLC elemzési eljárásra. Meghatározott időközökben kb. 0,1 ml-es mintákat veszünk a reakcióelegyből, a mintákat kb. 0,7 mg/ml végkoncentrációra hígítjuk 50:50 (térf./térf.) 0,2 %-os vizes NaHzPCbíacetonit'ril elegyével és beinjektáljuk a HPLC rendszerbe. A HPLC rendszer egy Hewlett-Packard 1084A kromatográf. Injektált térfogat: 20 pl. UV detektor: 254 nm. Oszlop: 25 cm-es Hibar-Merck, Lichrosorb RP-8-cal (7pm) átöltve. Eluálószer: A oldószer: NaHjPCh 0,02M/CH3CN 25/75 (térf./térf.) B oldószer: NaH2P04 0,02M/CH3CN 95/5 (térf./térf.) Grádiens: t, perc 0 2 25 30 35 % B 30 30 50 60 30 Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Néhány, találmány szerinti jellegzetes vegyület relatív retenciós idejét az I/b táblázatban mutatjuk be. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vegyületek mind lényegében tiszta teikoplaninszerű anyagokból, mind nyers teikoplaninszerű anyagokból előállíthatók. Az előbbi esetben olyan, találmány szerinti vegyülethez juthatunk, amely nem igényli további külön tisztítási lépés végrehajtását, míg az utóbbiban egy végső tisztítási lépés válik szükségessé. A tisztítást általában ismert eljárások szerint végezzük, amelyek közé tartozik pl. a kicsapás nemoldószerekkel, oldószeres extrakció, sóképzés és a kromatográfiás eljárások. Egy kitüntetett tisztítási eljárás fordított fázisú oszlopkromatográfiai alkalmazását foglalja magában. Ebben az esetben a kitüntetett adszorbens a szilanizált szilikagél, 0,06—0,2 mm részecskeméret eloszlási tartománnyal. Az eluálószer valamelyik hidrofil elegy lehet, amelyet a tisztítási eljárásokban alkalmaznak. Jellemző példák az ilyen hidrofil oldószerekre mint eluálószerekre a következők: szerves savak ammóniumsóinak híg vizes oldatai és acetonitril vagy vízoldható rövidszénláncú alkanolok különböző arányú elegyei. A szerves savak ammóniumsóinak híg vizes oldataira jellemző példák a 0,1—6 %-os vizes ammóniumformiát oldatok, míg a megfelelő alkanolokra példa a metanol, etanol, propanol stb. Kitüntetett eluálószer a vizes ammóniumformiát és acetonitril pH 6—8 elegye vagy vizes ammóniumformiát és metanol elegye. Egy kitünteteti eljárás a következőket foglalja magában: először fordított fázisú kromatográfiát végzünk szilanizált szilikagélen (0,06—0,2 mm), a kifejlesztés lineáris lépcsőn grádienssel (5—60 % acetonitril 0,2 %-os vizes ammóniumformiátban) végezve, majd egy második oszlopon kromatografálunk, eluálószerként 6:4 (térf./térf.) acetonitril: víz elegyet alkalmazva. Egy másik kitüntetett eljárás a következőkből áll: a) a nyers antibiotikumot 1:2:3 0,2%-os vizes ammóniumformiát:metanol:butanol elegyben oldjuk, szilanizált szilikagéllel hozzuk érintkezésbe és az oldószereket lehajtjuk; b) a maradékot felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlop (0,06—0,2 mm) tetejére, 9:1 0,6%-os vizes ammóniumformiát:acetonitril eleggyel kifejlesztést végzünk, az eluátumot elvetjük és az eluáiást lineáris acetonitril/vízben grádienssel folytatjuk, amelyet úgy alakítunk ki, hogy 200 ml/óra sebességgel elegyítünk 1:9 acetonitril:víz elegyet és 7:3 acetonitrikvíz elegyet. A „lényegében tiszta" kifejezés, egy — a leírásban szereplő antibiotikum vonatkozásában — olyan anyagot jelez, amelynek HPLC titere na-' gyobb, mint 95% (a csúcs-területek százalékos mennyisége az előre meghatározott UV hullámhosszúságon, 254 nm-en), víz és oldószer tartalma 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5b 60 65 5
