195979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
25 195579 26 frakció vegyület A-, ill. C-rendszerben mért Rt 18-20 10 mg M-citorodin 0.27 0.37 25 mg A-citorodin 0.27 0.41 Az M-citorodin és az A-citorodin között sem Kieselgélen végzett analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiéval, sem az A-rendszerrel végzett vékonyrétegkromatográfiával nem lehetett különbséget tenni. Szétválasztásukhoz alkalmasnak a C-rendszer (kloroform, metanol, 99%-os ecetsav és víz 75:15:10:2 arányú elegyet) bizonyult Kieselgél lemezeken: a C-rendszerben mért R^értékek: A-citorodin 0,41; M-citorodin 0,37. M-citorodin 1H-NMR: 13. ábra abszorpciós színkép: a) 235 (4.56) 253 (váll) 295 (3.83) 495 (4.1) b) 235 (4.58) 256 (váll) 296 (3.89) 496 (4.15) c) 244 (4.59)-305 (3.87) 610 (4.1) C34H43NO12, számított mólsúly: 657 ( ;fab-ms által igazolt). 18. példa W-citorodin elkülönítése preparatív HPLC segítségével A poláros Y-frakció 80 mg-jét kloroform, metanol 96%-os ecetsav és trietilamin 80:10: : 10:0,01 arányú, vízzel telített elegyének 2 ml-jében feloldjuk, 3,2x25 cm méretű, 110 g 7 p szemcseméretű Lichrosorb Si 60 Merck adszorbenssel töltött acéloszlopra adjuk és nyomás alatt, 8 ml/perc átfolyási sebesség mellett kromatografáljuk. 4 ml-es frakciókat szedünk, amelyeket analitikai HPLC segítségével minősítünk, majd az azonos tartalmú frakciókat egyesítjük és a szokásos módon feldolgozzuk. Nem azonosítható komponensek mellett 1,5 mg W-citorodint nyerünk. A vegyület DC Kieselgél 60 (Merck) lemezeket C-rendszerben mért Rf-értéke: 0,23. W-citorodin abszorpciós színkép: a) 235 (4.53) 495 (4.01) 253 (váll) 293 (3.64) b) 235 (4.57) 495 (4.13) 253 (váll) 293 (3.65) c) 241 (4.49)-282 (3.78) 575 (3.81) 610 (3.96) C60H8SN2O22, számított mólsúly: 1184. 14 A komponenseknek a példákban leírt azonosítása az alábbi mérési körülmények között történt. A proton-rezonancia-szinképeket (1H-NMR-szinképeket) BRUKER HX-270 típusú fourier-transform magrezonancia spektrométerrel vettük fel 270 MHz frekvencia mellett. A koncentrációk 2-4 mg/0,5 ml 99,8%-os CDCI3 közötti értékek voltak; az oldatokat - mindjárt előkészítésük után - nátrium-karbonát 99,5%-os Ü20-val készített 5%-os oldatának 0,1 ml-jével összerázzuk. Az ábrákon csillaggal jelölt csúcsuk ezrelékes mennyiségű kis molekulatömegű szennyeződésekre, valamint oldószermaradványokra vezethetők vissza. A tömegspektrumokat MS-902 S, AEI típusú tömegspektrométerrel, FAB (fast atom bombardment) ionforrás alkalmazásával, egyes esetekben ammónium-klorid adagolása mellett. Az abszorpciós színképeket 200-700 nm hullámhossz-tartományban mértük az alábbi rendszerekben: a) víz és metanol 1:9 arányú elegye b) 10% ln HC1 metanolban c) 10% In NaOH metanolban Az anyagok koncentrációja 10-30 mg/1 volt. A példákban az abszorpciós maximumokat nanométerben, valamint zárójelben a moláris extinkciós együtthatót (log £) adtuk meg. A citotixikus aktivitás meghatározása A citostatikus hatékonyság meghatározása az egér L1210 jelű leukémiasejtjein történt, az alábbi teszt-rendszerben: a) proliferációs assay A módszerre jellemző, hogy a sejteket in vitro a kísérleti anyagok különböző koncentrációval inkubáljuk, majd meghatározzuk, hogy a sejtek milyen mértékben képesek rádióaktiv DNA-prekurzorok (például C14-el jelzett timidin) beépítésére. Kezeletlen L12210-se jteket azonos kísérleti körülményeknek vetünk alá, ezek a kontrollt szolgáltatják. Az alábbiakban a módszert röviden leírjuk. A növekedés exponenciális fázisában (5xl03/ml RPMI-kőzeg) lévő L1210-sejteket mikrotiter lemezen 72 órán át a kísérleti anyag különböző koncentrációjával inkubálunk (37 °C, 5% CO2, 95% relatív páratartalma). A kontrollt képező sejteket csupán friss közeggel inkubáljuk. Minden meghatározás 4 ismétlésben készül. 65 óra elteltével 50 p C14-timidint (1,5 pCi/ml) adunk a tenyészethez, a sejtben lévő DNA rádióaktív jelölése céljából. 7 óra inkubálés után a sejteket leszívatjuk, a DNA-t 5%-os triklórecetsavval kicsapjuk és először vízzel, majd metanollal mossuk. 50 °C-on végzett szárítás után a DNA-ba beépített rádióaktivitást 5 ml szcintilláci-5 13: 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
