195858. lajstromszámú szabadalom • Eljárás teicoplanin A2 komplex egyes fő komponenseinek szelektív feldúsítására
7 195858 8 A találmány kivitelezéséhez felhasználható, TA-2 komplexet termelő tenyészetek fermentálásához alkamas táptalaj általában a következő anyagokat tartalmazza: valamilyen alkalmas szénforrás, mely lehet például cukor (pl. glükóz, szacharóz, mai tóz), poliszacharid (pl. keményítő, dextrán), polialkohol (pl. glicerin, propilén-glikol); egy megfelelő nitrogénforrás, mely lehet például ammóniumsó, aszparagin, borsóliszt, szójaliszt, húskivonat, tripton, pepton, élesztó-hidrolizátum, élesztőkivonat vagy gabonafőzel; savas ásványi BÓk, mint pl. kalcium-karbonát, nátrium-klorid vagy magnézium-szulfát. A fermentálást 50-200 órán át végezzük aerob körülmények között, 25 és 35 “C közötti hőmérsékleten. A megfelelő prekurzorok szelektíve hatásos mennyiségét hozzáadhatjuk a fermentációs közeghez a termelő törzszsel történő beoltás előtt, de célszerűen az erjedés megindulása után 24-28 óra múlva adjuk hozzá. Az adagolás történhet egy vagy több részletben, vagy pedig folyamatosan. A találmány szerinti eljárás egy tipikus kísérleti megvalósításában a ferde zabliszl-agaron tárolt Actinoplanns tcichomycoticus tenyészetet beoltjuk egy táptalajt tartalamzó, 100 ml-es lombikba. 36 óra elteltével a tenyészetből vett 5 ml-es mintákkal beoltunk egy sor erjesztőpalackot, melyek egyenként 100 ml fermentációs közeget tartalmaznak. 24-48 órás erjesztés után hozzáadjuk a megfelelő prekurzor szelektíve hatásos mennyiségét. Ha a T-A2 komplexben egyidejűleg két vagy több komponenst kívánunk feldúsítani, akkor ugyanahhoz az er jesztópalackhoz két vagy több prekurzort is hozzáadhatunk. A fermentálást további 60-150 órán át folytatjuk, majd a közeget centrifugálással eltávolítjuk, és az erjesztett mintákban nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (KPLC) meghatározzuk a T-A2 fő komponenseinek koncentrációját. A prekurzor hozzáadását általában úgy végezzük, hogy a fermentációs közeg előzőleg meghatározott pH értéke ne változzék meg. Ha pl. prekurzorként szabad savat adunk közvetlenül a közeghez, akkor a pH értéket vagy a közeg pufferolásával vagy pedig úgy szabályozzuk, hogy azonnal semlegesítjük egy, a mikroorganizmusra nem mérgező bázissal. Ha a felhasználandó prekurzor valamely aminosav, akkor a fermentációs közeghez hozzáadhatjuk vizes oldat, vagy olyan savakkal vagy bázisokkal képzett sók (pl. hidroklorid- vagy nátriumsók) alakjában, melyek a komplexet termelő mikroorganizmusra nem mérgezóek. Mind a racém keverékek, mind pedig az optikailag aktív izomerek használhatók prekurzorként, azonban bizonyos esetekben az I.-változat jobb eredményeket ad, mint a megfelelő D-izomer. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítási módjában L-aminosav prekurzorokat alkalmazunk: a teiooplanin A2 komplex T-A2-2 koncentrációjának növelésére valint, annak valamely sóját vagy észterét, a T-A2- 4 koncentrációjának növelésére I.-izoleucint, annak valamely sóját vagy észterét és»/vagy a T-A2-5 koncentráció növelésére L-leucint, vagy annak valamely sóját vagy észterét. A találmány ezen előnyös megvalósítási módjában a komplex T-A2-2, T-A2-4 vagy T-A2-5 koncentrációja 90-95%-ig is növelhető. A kis szénatomszámú alkánsav-prekurzorok (pl. izovajsav, 2-metil-vajsav, izovaleriánsav, alfa-oxo-izovaleriánsav, alfa-oxo-béts-metil-valeriánsav vagy alfa-oxo-izokapronsciv) hozzáadása történhet nem mérgező bázisokkal képzett sóik vizes oldata alakjában: rendszerint előnyösek az ammonium- és nátri'imsók. Ha prekurzorként telítetlen zsírsavak - pl. linói- vagy olajsav - sóit használjuk, akko^ általában előnyösek a nátrium- és ammóniumsók, de használhatjuk bármely olyan bázis sóját, mely a termelő mikroorganizmusra nem mérgező. Ha prekurzorként a fenti alkánsavnak vagy telítetlen zsírsavaknak 1-6 szénatomszámú monohidroxi-alkanolokkal képzett észterei". használjuk, ezek az észterek rendszerint a metanol, etanol vagy propanol származékai, de alkalmazhatunk C4-C6 alkanolokkal képzett észtereket is. Ezesetben ff Ct-Cs alkano’ nem lehet azonos azon alkoholokkal, melyeket a T-A2 komplex egyéb komponenseihez használunk prekurzorként (pl. izobutanol, izoamil-alkohol vagy 2-metil-butanol), kivéve, ha egyidejűleg ezen komponensek közíV egynek vagy többnek az arányát is növelni kívánjuk. A fenti, kis szénatomszámú alkánsavaknak és telítetlen zsírsavaknak kis szénatomszámú polihidroxi-alkanolokkal képzett észterei közül előnyösek az etilén-glikollal és a glicerinnel képzett észterek, mint pl. a triizob\ tirin, triolein vagy trilinolein. A telítetlen zsírsavak hozzáadását úgy is végezhetjük, hogy olyan természetes anyagokat alkalamazunk, melyek ezeket a savakat eredeti alakjukban vagy glicerideik alakjában tartalmazzák. Például a kereskedelmi forgalomban kapható szójaolaj általában kb. 20-35% olajsavat és kb. 50-60% linolsavat tartalmaz trigeliceridek alakjában; a sertészsír kb. 40-55% olajsavat; a gyapotmagolaj kb. <0-45% olajsavat és kb. 30-55% linolsavat; a napraforgóolaj kb. 15-25% olajsavat és kb. 65-75% linolsavat tartalmaz. Az alkanol prekurzorokat - mint pl. izobulanol, izoamilalkohol vagy 2-metil-butanol - általi ban eredeti alakjukban adjuk a fermentációd közeghez, de használhatjuk ezen alkoholol at a mikroorganizmusra nem mérgező savakkal képzett észtereik alakjában is. Ezen savaknak különbözniük kell azoktól, melyek a T-A2 komplex egyéb főkomponenseinek pre-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
