195855. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tumorellenes hatású LL-E33288 jelű antibiotikum-komplex és komponensei előállítására
30 195855 31 rogénforrást, (pl. fehérjéi, fehérjehidrolizátumol, polipeptideket, aminosavakal, kukoricalekvárt, atb.) és szervetlen anionokat és kationokat (pl. kálium-, nátrium-, ammonium-, kalcium-, szulfát-, karbonát-, foszfát-, kloridionokat, stb.) és bróm-forrást (pl. nátrium-bromidot) vagy jód-forrást (pl. kálium-jodidot) tartalmaznak. A tápközeg nyomelemeket (pl. bort, molibdént, rezet stb.) is tartalmaz, a többi komponensben jelenlevő szennyezések formájában. A fermentációs tankban vagy lombikban a levegőztetést oly módon biztosítjuk, hogy a fermentációs közegbe vagy felszíne alá steril levegőt nyomatunk. A tankokban a további keverést mechanikus eszközökkel végezzük el. Szükség esetén habzásgátlót (pl. szilikont) adhatunk a rendszerhez. Az LL-E33288 antibiotikumok izolálásának és szétválasztásának általános ismertetése: Az LL-E33288 antibiotikumokat a fermentléből extrakcióval (pl. szerves oldószerrel, mint pl. etil-acetáttal vagy diklór-metánnal) nyerjük ki. A szerves extraktumban levő antibiotikum komplexet kis szénatomszámú szénhidrogénekből végzett szelektív kicsapással tovább tisztíthatjuk. A kapott nyers LL-E33288 antibiotikum komplexet ezután oszlop-kromatográfiás lépések sorozatával tovább tisztítjuk és egyes komponenseire szétválasztjuk. Az oszlop-kromatografálást szilikagélen, Sephandex" (pl. Pharmaci Fine Chemicals) és Cis kötött kovasavon végezzük el. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük. J. példa Inokulum készítése Primer inokolum táptalaj tipikus összetétele a következő: marhahúsextrakt kb. 0.3 % tripton kb. 0.5 % dextróz kb. 0.5 % dextrin kb. 2.4 % kalcium-karbonát kb. 0.4 % élesztőextrakt kb. 0.5 % víz .100% ig A fenti tápközeg pH-ját 7-re állítjuk be majd sterilezzük. A steril tápközeg 100 ml-es részletét tartalmazó lombikot az NRRL 15839 törzs fagyasztott micéliumával inokuláljuk. A beoltott tépközeget forgó rázatógépen 48 órán ót 32 °C-on erőteljesen keverjük. Az inokulált tápközeggel inokulélunk 14 literes fermentorban levő 10 liter fenti steril tápközegel. Keverés közben 32 “C-on 48 órán át inkubáljuk. A kapott szekunder inokulumot használjuk fel tankban elhelyezett 300 liter fenti steril tápközeg inokulálására, majd 48 órán át 30 °C-on keverés közben (ford ulatszóm: 180-200 percenként) inkubáljuk. Ily módon tercier vagy beoltó inokulumot nyerünk. 5 2. példa Tank fermentáció Alábbi összetételű fermentációs készítünk: tápközeget dextróz kb. 0.5 % szaccharóz popton, bakteriokb. 1.5 % lógiai minőségű, kb. 0.2 % kétbnzisú kálium-foszfát kb. 0.01 % melasz kb. 0.5 % kalc.ium-kar bonét kb. 0.5 % bróm-forrás nyomokban v'z 100%-ig. 2800 liter fenti tápközeget slerilezünk majd 300 liter, az 1. példa szerint előállított 25 tercier (beoltó) inokulummal beoltjuk. A levegőztetés mértéke 0,53 liter steril levegő (1 fermentlé) perc, a keverés sebessége percenként 110 fordulat. A hőmérséklet kb. 28 °C-on tartjuk és a fermentációt 97 óra 30 -után megszakítjuk. A fermentációt ill. az LL-E33288 antibiotikum termelést a fermentlé antibakteriális aktivitásának meghatározása útján, biokémiai indukciós teszttel, TLC és HPLC analízissel 35 követjük nyomon. A teljes fermentlé pH-ját 6-ra állítjuk be, majd fele térfogatnyi etil-acetáttal exlraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot bepároljuk, a visszamaradó szirupot hexánnal 40 kétszer mossuk, majd diatomaföldön átszűrjük. A szűrőlepényt etil-acetáttal alaposan összekeverjük, majd szűrjük. A szűrletet 3 literre bepóroljuk, fölös mennyiségű vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, majd 45 hexán hozzáadásával kicsapjuk. Kb. 26,7 g nyers LL-E33288 komplexet kapunk. 3. példa 50 LL-E33288cn-Br, m-Br, ca-Br, és <a-Br elválasztása az LL-E33288/)i-Br, fii-Br és 71 -Br anyagoktól 55 A második példa szerint előállított 26,7 g nyers LL-E33288 komplexet (bróm-komplex) három egyenlő részre osztunk és három külön 2,4 x 110 cm-es töltött (Silica-WoelmR, 32-63 m. Woelm Palma) és 0.1 mólos 60 vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal egyensúlyba hozott szilikagéloszlopon kromatografáljuk. Az oszlopokat előbb a fenti oldószerrel 3 ml/perc áthaladási sebességgel 18 órán át eluóljuk és 18 ml-es frakciókat gyűjtünk 65 össze. Az eluálást ezután 95 : 5 arányú etil-17
