195839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978 C jelzésű ciklusos peptid származékok előállítására

9

195899

10

egyetlen terméket kapunk: a megfelelően blokkolt magoL.

11. Dozacilozó eljárás

A. Az enzim előállítása

1. A termelő mikroorganizmusok

Az A-21978C C„, Ci, Ci, Cs, C« és Cr. faktorok dozacilezésóre használható enzimek az Actinop/anes e's Streptosporangium nemzetségbe tartozó egyes mikroorganizmusok, előnyösen az Actinoplanes u tu Aeneis NRRL 12052 mikroorganizmus {deponálva 1979. ok- Lóhor í)—őri) ú{tal tormelhotók. Bár az 'enzim termelésére alkalmas az A. utahensis NRRL 12052 előnyös tenyésztési módszerét adjuk meg a zx 1. példában, a szakember számára nyilvánvaló, hogy egyéb eljárások is alkalmazhatók.

Néhány eddig izolált és jellemzett fajta és változat: Actinoplanes philippiensís, Actinoplanos armoniacus, Actinoplanes utahensis, és Actinoplanes miBsouriensis; Streptosporangium rosoum, Streptosporangium vulgare, Stroptosporangium rosoum, SlreptoBporangiuiri vulgaro, Stroptosporangium rosoum var. hollamlcnsis, Streptosporangium album, Stroptosporangium viridialbum. Amorphospornngium auranticolor, Ampuliarieiia rogularis, Az Actinoplanes nemzetség a találmányhoz használható enzim olőnyben részesített forrása. Az actinoplanes nemen belül az Adinoplnnok utahensis faj különösen előnyös enzimforrás.

Néhány egyéb hasznos fajtának tenyészotét a „Nothern Regional Research Center, Agricultural Research Culture Colection (NRRL), U.S. Department of Agriculture, 1815 North University St., Peoria, Illinois G1604, U.S.A." bocsátja a nyilvánosság rendelkezésére, a következő nyilvántartási számokkal:

Actinoplanes utahensis NRRL 1205

(deponálva 1979. október 9.)

Actinoplanes missouriensis NRRL 12053

(deponálva 1979. október 9.)

Actinoplanes sp. NRRL 8122

(deponálva 1975. október 17.)

Actinoplanes sp. NRRL 12065

(deponálva

' *1979. novombor 5.)

Streptosporangium roseum

var. hollandonsis NRRL 12064 (deponálva 1979. november 5.)

A törzs („parent") tenyészet, melyből az A. utahensis NRRL 12052 származik, részét Képezi az American Type Culture Collection•nek is (ATCC) (12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852) (A. utahensis ATCC 14539). Az A. utahensis ATCC 14539 tenyészet szintén használható enzimforrásként.

Az Annissuriensis NRRL 12053 az ATCC (enyészet-gyűjteményben ugyancsak deponált tenyészetből (A. missouriensis ATCC 14538) származik és az enzimnek egy másik forrását képezi.

Az Actinoplanes nemzetségen belül valamely adott mikroorganizmus törzs dezacilezö 'inlásosságát a következő eljárással határoztuk meg. Alkalmas táptalajt beoltunk a mikroorganizmussal. A tenyészetet rotációs rázógépen mintegy 30 °C-on 3 napig inkubáljuk. K/.után u szubsztrát antibiotikumok egyikót hozzáadjuk a tenyészethez, a fermentációs közeg píl-jnt körülbelül 7,0 értéken tartva. A tenyészet aktivitását Micrococcus Iutcus próbával mutatjuk ki, az eljárást a D. fejezetben ismertetjük. Az antibiotikus aktivitás csökkenése azt jelenti, hogy a mikroorganizmus termeli a dezacilezéshez szükséges enzimet. bzt azonban a következő módszerek valamelyikével kell igazolni: 1/ HI’LC-olemzés az ép mag jelenlétének kimutatáséra, vagy 2/ alkalmas oldallánccal (például lauroil-, n-dokanoil-, vagy n-dodekanoilcsoport) való űjraacilezcs az aktiviLás visszaóllílásu céljából. Az antibiotikus aktivitás csökkenése nehezen állapítható meg, ha biokkoR A-21978C unyugot dezacilozünk, minthogy a blokkoló csoport jelenléte az antibiolikus aktivitás 80- -90%-os csökkenését okozza.

2. Az enzimtermelés körülményei

Az enzim termeléso az Actinoplnnos fejlődése szempontjából kielégítő körülmények között történik, azaz mintegy 25-30 °C hőmérsékleten, mintegy 5,0-8,0 pll-tnrtomúnybun, rázás és levegőztetés közben. A táptalajnak a) asszimilálható szénforráHt, mint szacharózt, glükózt, glicerint vagy hasonlót, és b) nitrogénforrást, mint peptont, karbamidot, ammónium-szufátot vagy hasonlót; c) foszfátforrást, mint oldható foszfátot] cs szervetlen sókat kell tartalmaznia a mikroorganizmus növekedésének hatékony előmozdítása céljából. A növekedési ciklus megkezdődése után általában 40-G0 óra múlva képződik hatásos enziminenriyisóg és ez az enzimszint a növekedési maximum elérése után bizonyos ideig fennmarad. A képződött enzim mennyisége az organizmus fajtájától és különféle tenyésztési körülményektől függőón változik.

A szakember előtt ismert módon az enzimet termelő mikroorganizmusok - így az Actinoplanes utahensis NRRL 12052 - változóko-5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

G5

G