195734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpes simplex vírus elleni védőanyagok előállítására
33 195734 34 aszparaganmaradék foglal helyet (a levezetett szekvencia 40-es maradéka, vagy a fehérje 15-ös maradéka). A szomszédos aminosavak szekvenciájának megfelelően ez az nszparagin nem potenciális glikozilezési hely. Mivel ezen a helyen nem mutattunk ki 2-3lI-manrióz jelölést, úgy tűnik, hogy az aszpuragin a fehérjében nem tartalmaz glikozilesoportot. A fenti kísérletekből az az általános következtetés vonható le, hogy a gD-1 és gD-2 a feliérje N-terminális környezetében nagyon hasonlók, bár nem azonosak. A gD-1 Watson és munkatársai által jósolt és valóságos szekvenciája között mindössze egy különbség van (a 8-as helyzetben lévő metionin). Mivel a két vizsgálat céljára különböző IISV-1 törzseket használtak, ezek az adatok kihangsúlyozzák, hogy a különböző IISV-1 törzsek esetében a gD szekvenciája általában megmarad. A fenti adatok a gD-1 és gD-2 szekvenciáiban lévő első 30 aminosavra vonatkozóan nem mutatják egy epitop szekvenciáját, amely megfelel egy igazoltan immunológiailag hatásos, mikrobiálisan érvényesülő .gD-vel kapcsolatos' polipeptidnek, és a Watson és munkatársai által leírt fúziós poiipeptidben jelen van. Az 52-es, 53-as és 54-es maradékok esetleges kivételével a jósolt aminosavak egyikét sem jellemezték az expressziós vektorokkal, amelyek készítését Watsonék Írták. Csak a Pvull restrikciós helytől jobbra eső, gD-1 kódoló szekvencia tartományát alkalmazták. A 30 aminosavból álló szekvenciát felülvizsgáltuk abból a szempontból, hogy jelen van-e egy potenciális, típusra vonatkozóan közös epitop. A Hopp és munkatársai által (lásd fentebb) alkalmazott elemzés 3-4 hidrofil területet mutatott. A Chou és munkatársai módszerével (lásd fentebb) végzett elemzés két potenciális .görbületet" mutatott a szekvencia másodlagos szerkezetében. A görbületek egyike megfelelt a hidrofil szekvenciák egyikének a 11-es maradéktól a 15-ös maradékig terjedő tartományban [(36 )—tói (41 )—ig a feltételezett szekvenciában], az 5. táblázat szerint. Ez a szekvencia arginint, prolint és metionint tartalmaz. Számított molekulasúlya 600 körül van. Úgy látszik tehát, hogy ez a szekvencia az előzőleg a triptikus peptid analízis során jellemzett .F' fragmentum, amely magában foglalja az epitopot a VII csoport típusra vonatkozóan közös, monoklón antitestjével szemben. A fenti kísérleti eredmények alapján Merrifield [J. Am. Chem. Soc. S5, 2149 (1963)] általános módszere szerint szintetikus polipeptideket állítottunk elő, és megvizsgáltuk immunreaktivitásukat a VII csoportba tartozó .170" monoklón antitesttel. Az első szintetizált peptid 16 aminosavmaradékot tartalmazott, amely az 5. táblázatban lévő, 8-tól 23-ig terjedő maradékok másolata, plusz egy karboxíl-terminális cisztein. Egy második, 11 tagú szintetizált termék a 13-23 maradékokat és egy C-terminális ciszteint tartalmaz. Az első polipeptid immunreaktiv volt a VII csoportba tartozó monoklón antitesttel. A második polipeptid (amely nem tartalmazta azokat a metionin és alaninmarudékokat, amelyekről feltételezték, hogy az .F" fragmentumot magukban foglalják) nem reagált az antitesttel. Összhangban az in vitro aktivitás megfigyeléseivel, megkezdtük egy 10 egeret magában foglaló immunizáló programm végrehajtását. Öt állatnak a 17-tagú polipeptidet adagoltuk egerenként körülbelül 10 pg mennyiségben. A másik öt állatnak a 17-tagú polipeptidet a vivőfehérjéhez (KLI!) kovalensen kötve adagoltuk. A humorális válaszokra vonat!.ózó előzetes adatok rövid időn belül rendelkezésre fognak állni, és azt varjuk, hogy a kísérleti állatok immunválaszt fognak adni, azaz olyan antitesteket fejlesztenek ki, melyek a HSV fertőzéssel szemben védő hatásúak. A találmány ezért specifikusan kiterjed olyan új polipeptidekre, amelyek lényegében mind a gD-l-ben, mind a gD-2-ben jelenlévő aminosavszekvenciát másolják, tehát összetételük RNII-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR’- ahol R jelentése hidrogénatom vagy egy vagy több aminosav és R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisztlingyök. Előnyös az a polipeptid, amelyet a fentebb leírt immunizálási eljárások során alkalmaztunk, s amelynek szerkezete Nlh-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Fhe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-COR‘, ahol R’ cisztein-csoportot jelent. Más, előnyös, találmány szerinti polipeptid-szekvenciák magukban foglalják az 5. táblázatban kifejtett, teljes gD-1 szekvenciát, beleértve azt a típust is, amelynek 8-as helyzetében metionin vagy szerin van. Amint előzőleg már rámutattunk, találmány szerinti vakeinakészitményeket formulázhatunk úgy, hogy csak a találmány szerinti gD-l-et vagy csak a találmány szerinti gD-2-t vagy mindkettő keverékét immunológiai szempontból alkalmas hígító—, vivő- vagy segédanyaggal együtt tartalmazzák. A gyakorlatban megfelelők a befogadó szervezet 1 kilogrammjára számított 0,01 - 10,0 mikrogramni tisztított gD-l-et vagy gD-2-t tartalmazó adagolási egységek. Várható, hogy 0,1- -100 mikrogrammos összes adag olyan antigén-anyagtömeget jelent, amely elegendő a találmány szerinti védő hatású vakcinélási eljárások elvégzéséhez, és a gazdaszervezetben ennek megfelelő antitest-képződést eredményez, A találmány szerinti aktív polipeptidek kis molekulasúlya következtében (például mindössze 6 atninosav, szemben az összesen több, mint 3G0 aminosavval és szénhidrátokkal) megfelelően kevesebb mennyiségű polipeptid alkalmazható a találmány szerinti vakcinában. Bár találmányunk fenti leírását irnmunoiógiailag aktív gD-1 és gD-2 késztmények és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
