195733. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szövet plazminogén aktivátor és ezt hatónyagként tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
8 195733 9 ten vagy annál valamivel magasabb hőmérsékleten és 0,01 torr nyomáson fejezzük be. A kapott liofilizélt gyógyszerkészítmény nedvességtartalma általában kisebb, mint 2,5%. A vákuum szárítás befejeztével a liofilizált gyógyszerkészítményt tartalmazó műanyagvagy üvegedényt lezárjuk. A fagyasztott vizes oldat vákuumszáritás közben a víz eltávoztával a t-PA fiziológiailag elfogadható só formájában marad vissza. A találmány oltalmi köre tahát kiterjed a t-PA fiziológiailag elfogadható sóira, előnyösen savaddíciós sóira, ezen belül elsősorban hidrokloridsójára. A találmány szerinti eljárás első ízben teszi lehetővé olyan liofilizált gyógyszerkészítmény előállítását, amelyből nagy t-PA koncentrációjú parenterális oldat nyerhető. Ez a t-PA koncentráció nagyobb mint 100 000 Ne/ml, előnyösen nagyobb mint 500 000 NE/M1, különösen előnyösen nagyobb mint 1 000 000 NE/ml. A kezeléshez szükséges parenterális oldat előállításához a találmány szerint előállított liofilizált gyógyszerkészítményt semleges vagy savas pH-jú vízzel hígítjuk. Ha a liofilizált gyógyszerkészítményt lényegében izotónilcus vizes oldatból nyertük, úgy a hígításhoz is lényegében izotónikus vizet használunk. A t-PA biológiai aktivitást mutat a vérrögök fibrin hálójának feloldásában, és igy előnyösen alkalmazható trombotikus rendellenességek kezelésére [The Lancet, 1018-1020, 1981. november 7.; The Lancet, 842-847, 1985. április 13.; The New England Journal of Medicine 310(10), 609-613 (1984); és 312(14) 932-936 (1985)]. A találmány szerint előállított liofilizált gyógyszerkészítmény felhasználható tehát a humán- és állat-gyógyászat területén, elsősorban trombotikus rendellenességek kezelésére. A különböző trombotikus megbetegedésekre számos példa ismert a szakirodalomból, ezek közül kiemelhető a szívizominfarktus, a súlyos vénatrombózis, a tüdőembólia és a szélütés. A t-PA adagolásának módja általában intravaszkuláris, előnyösen intravénás infúzió, bár egyéb adagolási mód, igy intramuszkuláris adagolás is alkalmazható. Az intravaszkuláris infúziót általában infúziós tartályban vagy üvegben vagy elektromosan működtetett infúziós fecskendőben lévő parenterális oldattal valósítjuk meg. Az oldat az infúziós edényből a betegbe juttatható gravitáció vagy infúziós pumpa segítségével. A gravitáció hatáséra működő infúziós rendszer nem engedi meg az adagolás ellenőrzését, ezért, elsősorban nagy koncentrációjú oldatok esetében, előnyösen infúziós pumpát alkalmazunk. Legelőnyösebb azonban az elektromosan működtetett infekciós fecskendő alkalmazása, mivel ez teszi lehetővé az adagolás legpontosabb ellenőrzését. A trombótikus rendellenességben szenvedő emlős beteg kezelésére szükséges t-PA mennyiséget természetesen egy sor faktor határozza meg, igy a beteg kora és súlya, az igényelt kezelés pontos feltételei és súlyossága, az adagolás módja, amelynek megállapítása az orvos vagy állatorvos feladata. Koszorúér elzáródás feloldásához szükséges mennyiség általában 150 000-450 000 NE/kg testsúly óránként. így 70 kg súlyú felnőtt beteg kezeléséhez óránként 10 000 000- -30 000 000 NE, előnyösen mintegy 20 000 000 NE mennyiség szükséges. Előfordulhat természetesen, hogy súlyosabb megbetegedés esetén, így akut szélütés kezeléséhez nagyobb dózis szükséges. Ebben az esetben a hatásos mennyiség általában 7 000- -36 000 NE/kg testsúly óránként. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg, anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna. 1. példa A Molecular and Cellular Biology, 5(7), L750-1759 (1985) szerint előállított transzformáit CHO sejtvonalból nyert t-PA-t kromatográfiás úton tisztítjuk, majd a t-PA-t 0,17 M nátriumcitrátot és 0,01 vegyes% Tween 80- -t tartalmazó pH = 5,5 vizes oldat formájában összegyűjtjük. Az oldatot sósavval pH = 3,0- -ra állítjuk és H-10 szűrőn (Amicon Ltd, Anglia) ultraszűrés segítségéve] besűrítjük. A koncentrált vizes oldatot gélszűrő oszlopon (Sephadex G-150) 0,01 vegyes % Tween 80-t tartalmazó pH = 3,00,85 törneg%-os sóoldattal eluláljuk. A t-PA tisztított vizes oldatát egyszer felhasználható művesével besűrítjük. Az oldatot nátriumhidroxiddal pH = 5,5-re állítjuk és a szuszpenziót 2 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A kicsapott t-PA-t 4 °C - hőmérsékleten 30 percen keresztül 4000 g fordulattal centifugáljuk. A t-PA szemcséket 0,85 vegyes % nátriumkloridot és 0,01 vegyes% Tween 80-t tartalmazó vizes oldatban feloldjuk és sósavval pH = 3,0-ra állítjuk. A feloldáshoz annyi sóoldatot haszná-* lünk, hogy a t-PA koncentrációja 7 500 000- -10 000 000 NE/ml legyen. Ezt az oldatot a fenti sóoldattal tovább hígítjuk, sósavval pH = 3,0-ra állítjuk és a fenti sóoldat 10 vegyes% mannitolt tartalmazó oldatával hígítjuk 5 000 000 NE/ml t-PA és 25 mg/ml mannitol koncentráció eléréséig. A kapott oldatot sterilre szűrjük és 1 ml-enként üvegfiolába töltve -35 °C hőmérsékletre hűtjük. A vákuum szárítást 0,05 Torr nyomáson végezzük. Mintegy 24 óra elteltével a hőmérsékletet fokozatosan 5 °C-ra emeljük és ezen az értéken tartjuk 16 órán keresztül. Ezután a hőmérsékleten 25 °C-ra emeljük és a nyomást 0,02 Torr-ra csökkentjük és további 24 órán keresztül ezen az értéken tartjuk. Ezután a fiolákat 600 Torr nyomású nitrogén atmoszféra alatt lezárjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
