195648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4H-3,1-benzoxazin-4-on-származékok és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
47 195 648-75°C-on tároltuk. Az enzim kinyerését a fenti hivatkozásokban leírt módszerekkel végeztük: a sejteket fiziológiás sóoldatban mostuk, majd 1 m nátriumklorid és 0,1 % Brij 35 (gyártó: Sigma Chemical Co., No. P-1254) jelenlétében homogenizáltuk. Centrifugálás és polictilénglikolla! (mólsúly 20.000) szemben történő dialízissel végzett betöményítes után az. anyagot Sephacryl S-300 (gyártó: Pharmacia) oszlopon kromatografáltuk Az aktív frakciókat egyesítettük, a fentiek szerint betöményítettük és kromatografáltuk Sepharose CL-48 töltethez kapcsolt szarvasmarha-tüdő tripszin-inhibitor-affinitásgélen. Az aktív frakciókat egyesítettük, a fenti módon bctöméiíyitcttük úgy, hogy az aktív elasztázra nézve 0,3 mikromólos legyen, majd az I ml térfogatú alikvot részeket a felhasználásig megfagyasztva, - 75 °C-on tároltuk. 2. Szubszlrátum Metoxi - szukcinil - L - alani! - L - prolii - L - valil - N - nielil - kumarin - amidot a következő cégtől szereztük be: Peninsula Laboratories, San Carlos, California. I mM koncentrációjú oldatokat készítettünk dimetilszulfoxidban, és ezeket felhasználásig 4 °C-on tartottuk. 3. Inhibitorok A vizsgálandó (1) általános képletű vegyületeket dimetilszulfoxidban oldottuk, és 5, 10 vagy 20 mM koncentrációjú törzsoldatokat készítettünk. Ezeket szükség szerint továbbhígítottuk. 4. Puffer A puffer összetétele a következő volt: 25 mM N - (2 - hidroxi - eti!( - piperazin - N - )2 - etán - szulfonsav), 1 M nátriumklorid, 0,1 vegyes % Brij 35, pH = 7,8. 5. A vizsgsálat menete Egy Perkin-Elmer Model 650 40 fluoreszcenciaspektrofotométert a következőképpen állítottunk be: arány -„mode”, gerjesztés 370 nm-en, kibocsájtás 460 nm-en, teljes skálaérték I, 5 vagy 10 egység, a küvettarész 25 ”C-ra termosztálva. Olyan (I) általános képletű vegyületek esetén, amelyek maguk fluoreszkálok, a gerjesztő fénysugárzás hullámhosszúsága adott esetben 390 nm lehet, hogy minimális mértékű legyen a zavaró hatás. A készülék kiivettájába bemért 2,0 ml pufferhez keverés közben hozzáadunk 5 mikroliter szubsztrátumot és 20 mikroliter enzimet. A fluoreszcencia változását írószerkezettel regisztráljuk, és mérjük a kezdeti, inhibitor nélküli értéket, amely általában 0,8 egység/perc. A mintegy 2 percig tartó mérés után keverés közben inhibitort (0,5-20 mikroliter törzsoldatot) adunk a küvettához, és folytatjuk az adatok regisztrálását. A reakciót addig követjük, amíg új állandó érték nem alakul ki. A fenti eljárást több (4 6) inhibitorkonccntrációval megismételjük. Az adatok (szubsztrátumkoncentráció, inhibitorkoncentráció és megfigyelt reakciósebesség) alapján a legkisebb négyzetek módszerével, többszörös nem-lineáris regresszióval határozzuk meg a megfelelő egyenletet. Néhány vizsgált (l) általános képlciü vegyületre az 1. táblázatban adjuk meg pK, értékét. pK, = -log10(K,), ahoi K, az 50 %-os gátláshoz szükséges mólkoncentráció. 48 /. táblázat Az (1) általános képletben R1 R2 R3 X pK, etil-II 11 i-propil-NH-9,03 etil-H H n-butil-NH-8,38 metil-H H i-propil-NH-8,36 metilmetil-H i-propil-NH-8,23 metil-H H n-butil-NH-7,71 H II H NH2GlyLcuPro-7,68 H H H NH2LeuPro-7,67 H H H D-PhGlyOMc 7.56 H H H D-LcuOMc 7,43 H etil-H i-propil-NH-6,74 H H metil-i-propil-NH-6,23 H-NHH i-propil-NH-6,83 acetil XXIV. példa A szarvasmarha tripszin gátlásának vizsgálata 1. Enzim A tripszint (III. tipus) a Sigma Chemical Co. cégtől szereztük be. ! mM sósav-oldattal 0,25 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk belőle, és az oldatot a felhasználásig 4 °C-on tároltuk. 2. Szubsztrátum A 7 - (glularil - L - fcnilalanil - amido) - 4 - mctil- kumarin! a Sigma cégtől szereztük be, s acctonitril és dimetilszulfoxid 1 : I arányú elegyével 10 mM koncentrációjú oldatot készítettünk belőle. 3. Inhibitorok Mint a XXIII. példában. 4. Puífer A vizsgálatnál alkalmazott puffer összetétele: 25 mM N - (2 - hidroxi - etil) - piperazin - N - (2 - etán- szulfonsav), 0,1 M káliumklorid, pH = 7,8. 5. A vizsgálat menete Hasonló módon járunk el, mint a XXIII. példában. A vizsgált (I) általános képletű vegyületekre a II. táblázatban tüntetjük fel pK., értékét. Ennek definíciója megegyezik a XXIII. példában megadottal. II. táblázat Az (I) általános képletben R1 R2 R3 X pK, etil-H H i-propil-NH-7,27 etil-H H n-butil-NH-7,41 metilmetil-H i-propil-NH-6,45 II H H D-PhGlyOMc 7,19 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 25
