195619. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-B vírussal szemben orális vakcinák előállítására
1 195)619 2 A találmány tárgya eljárás vakcina előállítására melegvérű állatokban hepatitis B elleni antitest-képződés kiváltására olyan módon, hogy a hepatitis B antigént kódoló gént tartalmazó', élő rekombináns adenovírust enterális bevonatos dózisformává alakítjuk. Az orvosbiológiai kutatások egyik fő célkitűzése a virális fertőzés elleni védelem biztosítása immunizálás útján. Az egyik megközelítés szerint elölt vakcinákat alkalmaznak. Azonban az elegendő antigén-tömeg biztosítására az elölt vakcinából nagy mennyiségeket kell használni. Ezenkívül, az elölt vakcinák az előállítási eljárás során gyakran szennyeződnek nemkívánatos anyagokkal. A heterológ élő vakcinák, amelyekben génsebészetileg megfelelően átalakított adenovírust használnak, amely maga a vakcina, immunológiaiiag kiválónak mutatkoztak [Chanock, R. M. és munkatársai: JAMA, 195, 151 (1966)]. A találmány szerinti eljárás élő orális vakcina előállítására vonatkozik, amelyben vektorként adenovírust alkalmazunk. A jelenleg kereskedelmi forgalomban lévő adenovakcina élő, fertőző adenovírust tartalmaz, enterális bevonatos dózisformában. Ha a vakcinálandó alanynak beadják, a vírus áthalad a felső légúti rendszeren — ahol a betegséget kiváltó fertőzés valószínűleg létrejöhet —, és a bélben válik szabaddá. A bélben a vírus a bélfalban szaporodik, és annak elleném, hogy nem képes adenovírusos fertőzést okozni, mégis kiváltja az adenovírus-antitestek képződését, és ezáltal immunitást biztosít az adenovírus-fertőzés ellen. A találmány szerinti eljárással előállított vakcina olyan élő, fertőzőképes adenovírust tartalmaz, amelybe génsebészetileg más betegséget okozó organizmusok által termeli antigéneket kódoló géneket építettünk be, és az így átalakított adenovírust alkalmazzuk enterális bevonatos dózisfoi inában. Amikor a vírus a bélben felszabadul, a bélfalban szaporodni fog, és ezáltal antitest-képződést indukál, vagy sejt-me.diálta immunitást vált ki, mind az adenovírussal, mind egyéb kórokozó organizmusokkal szemben. Az élő vírus alatt — az elölt vírussal ellentétben — olyan vírust értünk, amely vagy önmaga, vagy egyéb genetikus anyaggal Kapcsolódva képes azonos utódok létrehozására. Fertőző kifejezés alatt azt a képességét értjük, hogy képes a virális genomot a sejtbe juttatni. Az Amerikai Egyesült Államokban évente közel 200 000 ember fertőződik Hepatitis B vírussal. Ezenkívül szoros összefüggés van a hepatitis B fertőzés és a májrák között. A jelenleg kereskedelmi forgalomban lévő hepatitis B elleni vakcinák injekciós készítmények, amelyeket egészséges vírusgazdák vérplazmájából állítanak elő, hosszadalmas eljárássá), számos egymást követő lépésben. Két fő hepatitis B virális antigén van: a felületi antigén (HBsÁg) és a mag-antigén (HBcAg). A HBsAg antigén-szerkezete meglehetősen komplex. Van egy közös, csoport-specifikus a összetevője. Ezenkívül, két pár egymást kölcsönösen kizáró típus-specifikus összetevője van, a d vagy y, és a w vagy r. A HBcAg egyszerű típusú antigén. Ismert, hogy a HBsAg vagy HBcAg elleni antitest immunitást biztosít a hepatitis B fertőzés ellen. A HBsAg szintetizálására mikroorganizmusok segítségével számos kutatócsoport alkalmazott rekombináns DNS-tcchnikát. HBsAg-t szintetizáltak már Escherichia coliban, fúziós protein formájában [Edman J. C. és munkatársai, Nature, 291, 503 (1981)]. Élesztőben is szintetizálták már a fenti antigént, ADH promotert alkalmazva [Valenzuela és munkatársai, Nature, 298, 347 (1982)], vagy savas foszfatáz promotert használva [Miyanohora és munkatársai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 1 (1983)]. Végül, tehénhimlő-vírust használtak vektorként a hepatitis elleni élő vírus vakcina előállítására [Smith és munkatársai, Nature, 302, 490 (1983)]. Az adenovírusok egy lineáris kettősszálú DNS molekulát tartalmaznak (móltömege 20 X 106—25 X X 106), amely 20 -30 polipeptidet kódol. Ezeknek többsége beépült a morfológiailag komplex vírus-részecskébe, és előállítási folyamatuk bonyolult. Korábban sikerült az SV40 T antigént expressziós rendszerben kifejezni, adenovirus rekombináns alkalmazásával [Solnick D., Cell, 2.4, 135 (1981); Thummel C. és munkatársai, Cell, 23, 825 (1981); Gluzman Y. és munkatársai: Eukaryotic Viral Vectors, 187. oldal, Cold Spring Harbor (1982)j. Az egér dihidrofolátreduktázt is sikerült expressziós rendszerben kifejezni, adenovirus rekombináns alkalmazásával [Berkner K. és Sharp P. A., Nucleic Acid Research, 12, 1925 (1984)]. Célunk olyan eljárás kidolgozása volt, amelynek segítségével melegvérű állatokban antitest-képződést vagy sejt-mediálta immunitást válthatunk ki egy fertőző organizmussal szemben, oly módon, hogy a kezelendő melegvérű állatnak orálisan, enterális bevonatos dózisformában olyan élő rekombináns adenovírust adagolunk, amely a fenti antitestnek megfelelő, vagy scjt-mcdiálta immunitást indukáló antigént kódoló gént tartalmaz. Célunk ezen belül olyan eljárás kidolgozása volt, amelynek segítségével melegvérű állatokban hepatitis B elleni antitest-képződést válthatunk ki, oly módon, hogy a kezelendő állatnak orálisan olyan élő rekombináns adenovírust adunk, amely hepatitis B antigént kódoló gént tartalmaz. A találmány tárgya tehát eljárás vakcina előállítására, melegvérű állatokban fertőző organizmusokkal szembeni antitestek vagy sejt-mediálta immunitás előidézése céljából, oly módon, hogy a fenti antitestnek megfelelő, vagy sejt-mediálta immunitást indukáló antigént kódoló gént tartalmazó, élő rekombináns adenovírust enterális bevonatos dózisformává alakítjuk, A találmány tárgya közelebbről eljárás vakcina előállítására, melegvérű állatokban hepatitis B elleni antitest-képződés kiváltására, oly módon, hogy a hepatitis B antigént kódoló gént tartalmazó, élő rekombináns adenovírust enterális bevonatos dózisformává alakítjuk. Adenovirus vektorok Három adenovirus vektort lehet egyszerűen szerkeszteni [Gluzman Y. és munkatársai: Eukaryotic Viral Vectors, 187. oldal, Cold Spring Harbor Labo-5 0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 6E 2
