195540. lajstromszámú szabadalom • Eljárás G- és V-penicillin előállítására fermentációs úton
1 195 540 2 I 1 A találmány tárgya eljárás G- és V-penicillin előállítására Pénicillium chrysogenum törzsek félfolyamatos, süllyesztett kultúrás tenyésztésével. Ismeretes, hogy a penicillin süllyesztett kultúrás előállítása volt az első ipari antibiotikum gyártó biotechnológiai folyamat, melynek biokémiai folyamatszabályozását megoldották. E folyamatszabályozás lényege az, hogy a tápanyagok oldatát olyan ütemben adagolják a tenyészethez, hogy azzal az anyagcserefolyamatok intenzitását a termelés szempontjából optimális értéken tartsák. A 180 399 számú magyar szabadalmi leírás az anyagcsereszabályozott korszert! penicillin fermentációs folyamat tipikus példáját mutatja be. E folyamatok gazdasági előnyei a nem anyagcsereszabályzott folyamatokhoz viszonyítottan a következőkből adódnak: — A hozamot döntő módon befolyásoló repressziós, és limitációs jelenségek elmaradnak. — A táptalaj a süllyesztett tenyésztés indításakor (beoltásakor) relatíve híg; kevés tápanyagot tartalmaz, ezért a tenyészet megfelelő oxigénátvitelt biztosító kevertetéséhez relatíve keyés energia (2-3 kW/m3) szükséges. — A tápanyagok adagolásával nemcsak az anyagcsere intenzitása, hanem a termelő mikroorganizmus szaporodása is befolyásolható; elkerülhető a túlzott viszkozitáshoz az oxigénátvitel leromlásához vezető túlszaporodás; biztosítható a legjobb oxigénátvitelt lehetővé tevő optimális pellet-méret. E folyamatoknak azonban a nem anyagcsereszabályzott folyamatokhoz viszonyítottan van egy jelentős gazdasági hátránya; a relatíve rossz fermentor-kapacitáskihasználás, ami abból adódik, hogy a tápanyagok oldatát adagolni kell. Ahhoz, hogy az adagolt oldatok beleférjenek a fermentorba, indulásnál a fermentlé térfogata csak jóval kevesebb lehet, mint amennyit a fennen tor hasznos kapacitása befogadni képes lenne; mintegy 65— 70%-a annak. Így a bioszintézist végző mikroorganizmustömeg is kevesebb, és csak a fermentáció végén éri el a maximumot, amikor a fermentlé térfogata a fermentor hasznos kapacitásáig emelkedik. Eljárásunk alapját az a felismerés képezi, hogy amenynyiben a fermentlé térfogatát a fermentor hasznos kapacitásának 90—95%-áról inditjuk, majd a tápanyagoldatok adagolása következtében amikor a hasznos térfogat 100%-át elérjük, a fermentlé 5-10 tf.%-át feldolgozásra leengedjük, majd az adagolást tovább folytatva a folyamatot többször megismételjük, végül is egy folyamatos fermentációhoz hasonló, közel állandó állapotot érhetünk el. Eljárásunk nemcsak arra alkalmas, hogy az anyagcsereszabályzott fermentációk tulajdonképpen egyetlen, de nagyon lényeges hibáját kiküszöbölje, hanem arra is, hogy további, a hozamot előnyösen befolyásoló lehetőséggel szolgáljon. Ezzel az eljárással a fermentlevek hatóanyagtartalmát is a táptalaj-kihasználás, a végtermékgátlás és a feldolgozás együttesen mérlegelt optimumértékén lehet tartani. Eljárásunk lényegesebb előnyeit (a fermentor kapacitás jobb kihasználása, időegység alatt több termék előállítása) az alábbi táblázatban feltüntetett adatokkal szemléltetjük.-----------------_--------j Hatóanyagtermelési sebességek összehasonlító táblázata Fermen- 1. példa 2. példa 3. példa 4. példa 5. példa tációs idő--------------------------------------—----------------köz, (óra) E/mi/óra E/ml/óra E/ml/óra E/ml/óra E/ml/óra 0- 40. 176 195 210 225 219 0- 60 225 242 237 304 296 0- 80 218 245 243 264 291 0-100 212 227 275 281 300 0-120 208 218 280 275 285 0-140 280 278 283 0-160 279 272 270 0-180 260 267 270 0-200 245 259 265 A fenti összegzett előnyökből adódóan eljárásunkkal 1 in3 fermentorkapacitás felhasználásával egy hónap alatt (720 munkaóra) 81,7, illetve 91,3 kg nyers G-, illetve V-penicillin-káliumsó bioszintetizálható, szemben az azonos törzzsel és azonos rendszerben hagyományos módon anyagcsereszabályzott (fed batch) technológiával, magasabb fajlagos anyagfelhasználás mellett elérhető 68,2 illetve 76,0 kg értékekkel. A fenti táblázatban az 1. és 2. példáknak megfelelő adatok, valamint a leírás 1. és 2. kiviteli példái a 189 287 számú magyar szabadalmi leírásban foglalt szakaszos fermentációs eljárásnak felelnek meg, illetve a nevezett eljárás reprodukciós példái. Eljárásunk kivitelezését a 3., 4. és 5. példákkal szemléltetjük. 1. példa A BIOGAL Gyógyszergyár tulajdonában lévő ipari termelésre alkalmazott URC M jelzésű Pénicillium chrysogenum törzsből (deponálási szám 1 MNG-00237) 80 liter előfermentációt készítettünk. Az előfermentációt 630 liter alaptáptalajba oltottuk, melynek összetétele a következő volt: (földi) mogyoróliszt kukoricalekvár 2,5 tf.% (100% szárazanyagtartalom) l,0tf.% nátriumtioszulfát 0,06 tf.% kalciumkarbonát 0,78 tf.% napraforgóolaj 0,28 tf.% A fermentációs paraméterek a következők voltak: felhasznált energia 800 liter fermentlé térfogatnál mérve 2,6 kW/m3 hőmérséklet 25 °C belső nyomás 105 Pa levegőztetés 1 Nm3/lm3 f.lé/perc A fermentációt 120 órán át futtattuk. Ezalatt összesen 10,9 tömeg% szénforrást adagoltunk a tenyészethez, a szénforrás 8 t.%-a napraforgóolaj, 92 t.%-a szaharóz volt. A fermentáció 10 órás korában 0,06 t.% fenilecetsav oldatot adagoltunk a fermcntléhcz, majd a fermentáció 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
