195537. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás antraciklin-származékok előállítására

1

195 537

2

végeztük. Részletesen a következő vizsgálati rendszert alkalmaztuk:

a) proliferációs vizsgálat

Ennél a módszernél meghatároztuk, hogy a sejteknek különböző koncentrációjú teszt anyaggal történt in vitro inkubálása után a sejtek milyen mértékben kénesek beépíteni a radioaktív DNS előfutárt (például a 14C jelzésű timidint). A kezeletlen L1210 sejteket hasonló körülményeknek vetjük alá, amelyek kontroll anyagként szolgálnak. A továbbiakban röviden leírjuk a módszert:

Az L 1210 exponenciálisan növekvő-fázisú sejteket (5X103/ml RPMI 1640-ben) mikrotiter lemezen különböző koncentrációjú teszt anyaggal inkubáljuk (37 °C hőmérsékleten, 5% C02, 95% relatív páratartalom). A kontroll anyagok olyan sejtek, amelyeket csak friss közeggel inkubálunk. Az összes meghatározást négyszeres meghatározásként végezzük el. 65 óra elteltével hozzáadunk 50 pl 14C-timidint (55,5 kBq/ml) azért, hogy a sejtek DNS-eit radioaktívvá tegyük. Hét órás inkubálás után leszívatjuk a sejteket, a DNS-ckct 5%-os triklór-ccetsavval kicsapatjuk és egymásután mossuk vízzel, illetve metanollal.

50 °C hőmérsékleten végzett szárítás után és 5 ml szcintillációs folyadék hozzáadása után megvizsgáljuk á DNS-be beépült radioaktivitást. Az eredményeket a teszt anyaggal végzett inkubálás után adjuk meg a kezeletlen kontroll anyagokra vonatkoztatott %-ban, a szcintillációs index arányaként.

Az így kapott mérési eredményekből meghatározzuk a dózis-hatás görbéket és grafikusan megadjuk az IC50-t, azaz azt a koncentrációt, amely a vizsgálati körülmények között a radioaktív timidin beépülését a kontroll anyaggal szemben 50%-kal csökkentette.

A találmány szerinti vegyületeknek az adriamicinhez (ADM) hasonlított ICS0 értékeit az 1. táblázatban foglaltuk össze.

b) kolónia képzés

Az L1210 leukémiás sejtek kolónia képzése lágy agaron.

Ezzel a módszerrel kimutatható a teszt anyagnak több generáción keresztül a sejtnövekedésre kifejtett hatása (10—12 órás sejt-ciklus idő esetén 7 napos vizsgálati idő alatt kb. 14 egymásután következő generációt figyeltünk meg).

Ebben a vizsgálatban a citosztatikus hatású anyagok a kezeletlen kontroll anyagokhoz viszonyílva a megfigyelhető kolóniák számának csökkenését idézték elő. A vizsgálatot részletesen a következőképpen folytattuk le:

Lemezenként 500 leukémiás sejtet inkubáltunk egy óra alatt, 37 °C hőmérsékleten, a tesztanyág különböző koncentrációival. Ezt követően a sejteket kétszer mostuk McCoy5A közeggel (McCoy és munkatársai, Proceedings Soc. Exp. Biol. Med. 100 (1959), 115. old.; Iwakata és munkatársai, N. Y. State Journal Med. 64(1961), 2279. old.), és végezetül 0,3 % agar hozzáadása után kiöntöttük Petri-csészébe. A kontroll anyagokat csupán friss közeggel inkubáltuk.

Az egy órás inkubálás helyett néhány esetben a felső agar-réteg tesztanyagának különböző koncentrációit kevertük hozzá, hogy így a teljes inkubálási idő alatt a sejtek folytonos expozícióját érjük el. Az agar megszilárdulása után a lemezeket 7 napra 37 °C hőmérsékletre inkubátorba tettük (5% C02, 95% relatív párata talom). Végezetül megszámoltuk a keletkezett 60 p átmérőjű kolóniákat. Az eredményeket a kezelt agarlemez kolóniaszámaként adtuk meg a kezeletlen kontroll anyagra vonatkoztatott %-ban.

5 Az így kapott dózis-hatás görbékből megadtuk az ICS0 értéket, mint az anyag hatásosságának mértékét. A találmány szerinti vegyületeknek az adriamicinhez hasonlított eredményeit az 1. táblázatban foglaltuk össze.

10

1. táblázat

15

Proliferációs vizsgálat IC so (Mg/ml)

Kolónia képzés •C50 (Mg/ml)

7 nap 1 óra

inkubálás * 1

ADM

6,0X10~3

2,2X10-2

4,4 XKT 2

Citorhodin U

2,5 XKT3

2,7X10-3

2.8X10-2

Citorhodin V

2,8X10“4

3 XKT3

1,1 XKT2

Chorhodin P

2.6XKT3

3,2X10-4

2.8X10-3

1—OH

Citorhodin U

2,8X10-3

4,5 XKT4

2,4X10-3

1—OH

Chorhodin V

2,8X10~3

4,5 XKT3

2,4X10~3

1—OH

Citorhodin B

5 X10~3

3 XKT 3

2,5 X10-3

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (I) általános képletű vegyületek előállítására - a képletben

35 R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport és

R' jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike - Roa-Rod-Rod vagy 40 — Roa-Rod-Acu

és R2 jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike:

— Roa-dF = CinB

— Roa-Rod-Acu

45 — Roa-dF-CinA vagy

— Roa-Rod-CinA

amelyekben a rövidítések jelentése a következő: Roa: rodozamin; dF: dezoxi-fukóz; Rod: rodinóz; Acu: akulóz; CinA : cinerulóz A és CinB : cinerulóz B és dF = CinB 50 azt jelenti, hogy mindkét cukor építőelem, a dezoxifukóz és a cinerulóz B, a szokásos glikozidos kötés mellett még egy éter-kötéssel is kötődik — azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletű vegyületet — a képletben

R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport és

R3 jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike:

— Roa-dF-Rod 60 - Roa-Rod-Rod

és R4 jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike:

— Roa-dF-Rod 55 — Roa-dF-CinA

7