195537. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás antraciklin-származékok előállítására
1 195 537 2 Ezt a közeget szétosztottuk Roux-üvegekbe és 21 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáltuk, lehűtöttük, spóraszuszpenzióval beoltottuk és 25 °C hőmérsékleten 7- 14 napig inkubáltuk. Ez idő múltával jó fejlődést, és spóraképződést állapíthattunk meg. Ebből a tenyészetből előállítottunk steril 0,8%-os NaCl oldatban 107 spóra/ml koncentrációjú spóraszuszpenziót. A következő 50 ml előtenyészet közegéhez oltóanyagként 2 ml spóraszuszpenziót használtunk fel: glükóz 15 g szójaliszt 15 g kukoricalekvár (szilárd) 5 g CaC03 2 g NaCl 5g desztillált víz 1 1 PH 7,0 A megadott közegből 50-50 ml-t öntöttünk 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokba és 121 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáltuk. A beoltott lombikokat 25 °C hőmérsékleten, 200 ford/perc fordulattal 2—3 napig rotációs rázógépen inkubáltuk. A kifejlődött tenyészetből 10 ml-t használtunk fel oltóanyagként a következő tenyészethez: glükóz 20 g maláta extraktum 10g élesztő extraktum 4 g desztillált víz 1 1 PH 6,8 A megadott közegből 500--500 ml-t öntöttünk 2000 ml-es Erlenmeyer-lombikokba és 121 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáltuk. A beoltott lombikokat 4—5 napig 25 C hőmérsékleten 200 ford/perc fordulattal rotációs rázógépen inkubáltuk. A kifejlődött tenyészetet leszedtük, centrifugáltuk, és a sejteket NaCl oldattal mostuk. Az enzimes átalakításhoz vagy az összes sejtet, vagy ezeknek a sejteknek a membrán-frakcióit használtuk fel. 3. példa A citorhodin U előállítása 35 mg citorhodin B-t [a (II) általános képlctíí vegyület képletében R3 jelentése -Roa-Rod-Rod és R4 jelentése -Roa-dF-CinA] feloldottunk 3 ml 96%-os etanolban, majd az elegyet 30 ml 5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferral feltöltöttük és összekevertük 37 °C hőmérsékleten, 150 ford/perc fordulattal 1,4 ml Str. galilalcaus (1,6 U/ml) törzsből előállított oxidoreduktázzal. Az átalakítást HPLC-vel ellenőriztük: kromatográfiás kolonna (Lichrosorb WSi 60,7 p (Merck); eluens: kloroform metanol :96 %-os ecetsav :víz :trietil-amin 80:10:10:2:0,01; eluensáram: 0,5—1,5 ml/min; detektálás 495 nm-en; a detektálás átfolyásos fotométerrel történt. 48 óra elteltével a kiindulási vegyületet már nem lehetett kimutatni. A reakcióoldalot 200 pl 0,1 mól/1 EDTA-oldattal összekevertük, majd az elegy pH-ját 7,5-re beállítottuk 1 n NaOH oldattal és háromszor extraháltuk 10—10 ml etil-acetáttal. Az etil-acetátos fázist Na2S04-tal víztelenítettük, majd a víztelenítőszert elválasztottuk, és az oldatot vákuumban óvatosan bcpároltuk. A 25 mg maradékot a már megadott eluensben feloldottuk és 35 g Lichrosorb (R)Si 60, 7 p (Merck) szilikagéllel töltött 16X250 nm-es acéloszlopon 10 ml/min áramlási sebességgel kromatografáltuk. Az analitikai HPLC-vel kapott citorhodin U vegyületet tartalmazó 60—70 frakciókat (2 mi kénti) összeöntöttük, vákuumban bcpároltuk és a maradékot feloldottuk 4 ml 3,5 pH-jú Na-acetát oldattal. Az oldatot összekevertük 0 1 ml 1 mmól/1 EDTA oldattal és toluoÜal zsír- és lágyítómentesre mostuk, majd a pH-t 7,5-re beállítottuk 1 n NaOH oldattal, és a nyersterméket metilén-kloriddal cxtraháltuk. A szokásos Na2S04 felett végzett víztelenítés és vákuumos bepárlás után 1 mg tiszta citorhodin U-t állítottunk elő. Citorhodin U: piros, amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban és toluolban, oldhatatlan vízben és hexánban, oldódik 1%-os vizes D glükonsav oldatban vagy D-laktobionsav oldatban. Rétcgkromatográfia: Réteglap: Merck szilikagél 60 FiS4-készréteglap; oldószer-rendszer: metanol: 96%-os ecetsav:víz 80:10 :10 :2; Rf=0,25. 'H-NMR: 1. ábra mutatja a vegyület tömegspektrogiáfiás felvételét. A vegyület abszorpciós spektruma: a) 234 (4,67) 253 (SCH) 295 (3,86) 495 (4,10) b' 235 (4,68) 253 (SCH) 295 (3,92) 495 (4,18) c) 244 (4,70) - 290 (SCH) (3,84) 580, 610 (4,18) (FAB — tömegspektrográffal történt a meghatározás) CsoHmNjOí! molekulatömeg 1168 Citorhodin U esetében a (1) általános képletben R1 jelentése -Roa-Rod-Rod és R2 jelentése-Roa-dF = CinB. 4. példa Citorhodin V előállítása 69 mg citorhodin A-t [a (II) általános képletben R3 és R4 jelentése -Roa-Rod-Rod] D-glükonátként (megfelel 54 mg citorhodin A szabad bázisnak) feloldottunk 45 ml 5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferban és összekevertük 37 °C hőmérsékleten 150 ford/perc fordulattal 2 ml Streptomyces galilaeus törzsből készített oxidoreduktáz oldattal. Az átalakítást HPLC-vel ellenőriztük. 48 óra elteltével a kiindulási vegyületnek 35%-a átalakult. A reakcióoldatot megfagyasztva tároltuk. A felengedés után hozzáadtunk a reakcióoldathoz 0,2 ml 0,1 mmól/1 EDTA oldatot, a pH-t 1 n NaOH oldattal 7,5-re beállítottuk, és az elegyet etil-acetáttal (háromszor 30—30 ml-rel) cxtraháltuk. Az elválasztott szerves fázist Na2S04-tal víztelenítettük és csökkentett nyomáson óvatosan bepároltuk. A maradékot (33 mg) a 3. példához hasonlóan az eluensben feloldottuk és preparatív HPLC-vel elválasztottuk. A 30—45 frakció az átalakítási, terméket, a 90—120 frakció a nem átalakított kiindulási terméket tartalmazta. Az átalakítási terméket a 3. példa szerint zsír és lágyítómentesre mostuk, és amorf, piros porként elválasztottuk (1,0 mg). Citorhodin V: piros, amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, ctil-acctálban, kloroformban és toluolban, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
