195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
1 195 535 2 szekvenciát. A transzfer vektort használjuk a klónozott cDNS-t kifejező baktériumok transzformálására. A cDNS-módszerrel előállítjuk a szarvasmarha növekedési hormont meghatározó DNS-szekvenciát. A cDNS- módszer alaptechnikáí ismertek, és Seeburg és munkatársai, továbbá Dérynék és munkatársai előzőekben ismertetett munkáiból megismerhetők. A cDNS szintézisére szarvasmarha agyalapi mirigyből extrahált RNS templátot használunk. Az RNS-t a szarvasmarha agyalapi mirigyéből ismert módszerekkel izoláljuk. A poli-adcnilezctt RNS-t affinitás-kromatográfiával izoláljuk. A poli-adenilezett ribonukleinsav integritását a poli-adenilezett RNS sejtmentes rendszerbe való transzlációjával bizonyítjuk, ahogy azt Miller és McCarthy [J. Biol. Chem., 254, 742(1979)] és Martial és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 74, 1816 (1977)] közli, a keletkező proteineket pedig nátrjum-dodecil-szulfát-akril-amid gél-elektroforézissel vizsgáljuk, ahogy azt Laemmli írja [Nature, 227, 680 (1970)]. A szarvasmarha növekedési hormonjának további azonosítását immun reakciókkal végezzük, ahogy azt Martial és munkatársai közük a fenti folyóiratban. A poli-adenilezett RNS-t használjuk templátként a cDNS (kétszálú) másolat előállítására. Az előállítást ismert módszerekkel végezzük. Az első cDNS szálat reverz transzkriptáz enzimmel, oligo-dT primerrel és a poli-adenilezett RNS-sel végezzük, ahogy azt Miller és McCarthy közli a fenti közleményükben, továbbá, ahogy Monahan és munkatársai írják [Biochem., 15, 223 (1976)]. A ribonukleinsavat alkalikus emésztéssel távolítjuk el, az egyszálú cDNS-t pedig felhasználjuk a második szál reverz transzkriptáz enzimmel való előállítására. Az egyszálú hurkot S1-nukleázzal lehasítjuk [lásd Leong és munkatársai, J. Virol., 9, 891 (1972); továbbá Ullrich és munkatársai, Science, 196, 1313 (1977)]. A cDNS ezután kész megfelelő transzfer vektorba való beépítésre. Transzfer vektorként előnyösen olyan molekulákat használunk, amelyekkel baktériumokat, például Escherichia coli-t és Bacillus subtilis-t, élesztőt, például Saccharomyces cerevisiae-t, a Neurospora crassa in!, csp és csp mutánsait, továbbá szövettenyészetben lévő állati sejteket transzformálhatunk. A találmány szerinti eljárás során például az E. coli transzformálására használható pSCIOl, pMB9, pBR313,pBR315, pBR316 és pBR322 plazmidokat, bakteriofágokból származó vektorokat, például a Charon 3A, Charon 4A, Charon 16A és lambda gtWES • lambda B vektorokat használjuk. Az I. táblázatban megadjuk a fenti transzfer vektorok leírását és izolálását közlő irodalmat. I. Táblázat Transzfer vektor Irodalom pSCIOl Cohen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei,, USA, 70, 1293 és 3240, 1977. Boyer és munkatársai, Recombinant Molecules, Beers és munkatársai, Eds., Raven Press, New York, 13. oldal, 1977. Transzfer vektor Irodalom 1 Cohen és munkatársai, Recombinant Molecules, 91. oldal. pMB9 Rodriguez és munkatársai, Molecular Mechanisms in Control of Gene Expression (ICN-UCLA Symposium on Mol. & Cell. Biol. Vol., 5. köret), Nicslich és munkatársai, Eds., Academic Press, New York, 471. oldal, 1976. Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 75, Î977. pBR313 Bolivar és munkatársai, lásd fent. pBR 315 Rodriguez és munkatársai,lásd fent. pBR316 Rodriguez és munkatársai, lásd fent. pBR322 Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 95, 1977. Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 121,1978. Sutcliffe,Cold Spring Harbor Symp on Quant. Biol, 43, 77,1978. Charon 3A Blatiner és munkatársai, Science, 196, 161, 1977. Charon 4A Blaltncr és munkatársai, lásd fent. Charon 16A Blattner és munkatársai, lásd fent. lambda gtWES • • lambda B Tremeier és munkatársai, Nature 263, 526, 1976. Leder és munkatársai, Science, 196, 175. 1977. Más, az E. coli transzformálására használható vektorokat közöl Sinsheimer [Ann. Rev. Biochem , 46, 415 (1977)]. A B. subtilis transzformálására használható vektort közölnek lordancscu, J. Bacteriol., 124, 597 (1964) és Ehrlich [Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74, 1680 (1977)]. Egy ilyen vektort pCl 94-nek neveztek el. Az élesztő transzformálására élesztő dezoxi-ribonukleinsavat (plazmid és/vagy kromoszomális), és bakteriális dezoxi ribonukleinsavat (például plazmid) tartalmazó hibrid plazmidokat használnak. Ilyen plazmidokat közöl például Beggs [Nature, 275, 104 (1978)]; Asiav és Carbon [Proc. Natl. Acad. Sei., US, 76, 3829 (1979)], továbbá Kingsman és munkatársai [Gene, 7, 141 (1979)]. Állati sejtek transzformálására használható transzfer vektorok például az Adeno defektiv vírus, az SV-40 defektiv vírus, és a polyoma vírus. A cDNS-t a transzfer vektorba ismert módszerekkel épitjük be. A cDNS-t általában bármely olyan restrikciós helyre beépíthető, amely nem túl gyakori a transzfer vektorban. A Charon 3A és 4A, továbbá a lambda gtWES • •lambda B nem tartalmaz ifyer, helyeket, ezért ezen vektorok esetében korlátozott számú restrikciós helyet használunk. A különböző transzfer vektorokban lévő, egyedülálló restrikciós helyeket és a Charon 3A és 4A, továbbá a lambda glWES lambda B vektorokban használható restrikciós helyeket a II. táblázatban ismertetjük. 5 10 15 20 75 30 35 40 45 50 55 60 65 4
