195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
1 195 535 2 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás szarvasmarha növekedési előhormon cDNS-ét tartalmazó vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy szarvasmarha növekedési hormont tartalmazó szövetekből, előnyösen agyalapi mirigyből RNS-t izolálunk, a poli-A-RNS-t reverz transzkriptáz segítségével egyszálú, majd kétszáiú cDN-sé alakítjuk, az egyszálú nyúlványokat lehasítjuk, és a) a kétszáiú cDNS-t dCTP jelenlétében terminális transzferázzal kezeljük, így dC végeket alakítva ki, eközben pBR322 plazmidot Pstl-el hasítunk, és dGTP jelenlétében terminális transzferázzal kezeljük, így dG végeket alakítva ki, ezt a fenti, dC végekkel ellátott cDNS-hez ligáijuk, vagy b) a kétszáiú cDNS-hcz Mind III linkcrckct ligálunk, az így létrejött anyagot Hind lil-mal emésztjük, és pBR322-höz, vagy pSC 101-hez, vagy pMB9-hez, vagy pBR313-hoz, vagy pBR315-höz, vagy pBR316-hoz ligáijuk, vagy c) kétszáiú cDNS-hez Sat 1 linkereket ligálunk, az így létrejött anyagot Sál I-el emésztjük, és pBR322-höz, vagy pSCIOl-hez, vagy pMB9-hez, vagy pBR313-hoz, vagy pBR315-höz, vagy pBR316-hoz ligáijuk, vagy d) a kétszáiú cDNS-hez Bam Hl linkereket ligálunk, az így létrejött anyagot Bam Hl-vel emésztjük, és pBR322-höz, vagy pSCIOl-hez, vagy pMD9-hez, vagy pBR313-hoz, vagy pBR315-höz, vagy pBR316-hoz ligáijuk, vagy e) a kétszáiú cDNS-hez Eco RÍ linkereket ligálunk, az így létrejött anyagot Eco RI-vel emésztjük, és pBR322- höz, vagy pSCIOl-hez, vagy pMB9-hez, vagy pBR313- hoz, vagy pBR315-höz ligáijuk, vagy 0 a kétszáiú cDNS-hez Pst I linkereket ligálunk, az így létrejött anyagot Pst I-el emésztjük, és pBR322-höz. vagy pBR315-höz, vagy pBR316-hoz ligáijuk, vagy g) a kétszáiú cDNS-hez Eco Rí Ünkereket ligálunk, az így létrejött anyagot Eco RI-vel emésztjük, és Charon 16A-hoz, vagy Charon 3A-hoz, vagy Charon 4A-hoz, vagy lambda gt • WES-lambda B-hez ligáijuk, vagy h) a kétszáiú cDNS-hez Hind III linkcrckct ligálunk, az így létrejött anyagot Hind IlI-mal emésztjük, és S. aureus eredetű pCl 94-hez ligáijuk, a fenti a)-h) lépések bármelyikének ligációs keverékét E. coli 1776-ba, vagy E. coli RRI-be, vagy E. coli DP50- bc, vagy E. coli DP50 SupF-bc transzformáljuk, antibiotikum-rezisztencia, vagy galaktozidáz-aktivitás alapján transzformánsokat izolálunk, szarvasmarha agyalapi mirigy cDNS segítségével telep-hibridizájást végzünk, a hibridizálódó telepekből plaznúdokat választunk ki, és ezekből a 830—831. bázispáros beépített szakaszt tartalmazó piazmidokat kiválasztjuk. 2. Eljárás szarvasmarha növekedési hormont meghatározó cDNS előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti 830—831. bázisnáros beépített szakaszt tartalmazó bázisok közül a) az I. igénypont a) eljárása alkalmazásával készült plazmidot Has II endonukleázzal hasítjuk, vagy b) az 1. igénypont b) és h) eljárása alkalmazásával készült plazmidot Hind III-al, majd Hae II endonukleázzal hasítjuk, vagy c) az 1. igénypont c) eljárása alkalmazásával készült plazmidot Sál I-el, majd Hae II endonukleázzal hasítjuk, vagy d) az 1. igénypont d) eljárása alkalmazásával készült plazmidot Bam Ul-vel, majd Hae II endonukleázzal hasítjuk, vagy e) az 1. igénypont e) és b) eljárása alkalmazásával készült plazmidot Eco RI-vel, majd Hae II endonukleáz- 7,8! hasítjuk, vagy f) az 1. igénypont f) eljárása alkalmazásával készült pl izmidot Pst I-el, majd Hae II endonukleázzal hasítjuk, — a fenti a)—f) eljárásokkal előállított hasítási keverékekből 1600 bp-es fragmenseket izolálunk, és 1) ezt DNS polimeráz I Klenow-fragmenssel, vagy T4 DNS polimerázzal vagy 3'-5' exonukleázzal kezeljük dATP jelenlétében, majd Sí nukleázzal kezeljük, így olyan szarvasmarha növekedési hormont, amely a 2. aminosavnál fcnilalaninnal kezdődik, egyébként az 1. ábra szerinti szekvenciájű, meghatározó cDNS fragmenseket nyerünk, vagy 2) ezt DNS polimeráz I Klenow-fraginenssel kezeljük dATP, dGTP, dCTA és dTTP jelenlétében, az így létrejött anyagot DNS polimeráz 1 Klenow-fragmenssel, vagy T4 DNS polimerázzal vagy 3'-5' exonukleázzal kezeljük dCTP jelenlétében, így az 1. ábra szerinti szekvenciájű növekedési hormont meghatározó cDNS fragmenseket nyerünk. 3. Eljárás szarvasmarha növekedési hormont meghatározó cDNS-t tartalmazó plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont I) vagy 2) eljárása szeánti cDNS-t megfelelő vektorba visszük be az 1. igénypor than bemutatott módon, így az 1) eljárás szerinti cDNS esetében olyan szarvasmarha hormont, amely a 2. iminosavná! fenilalanínnal kezdődik, egyébként az 1. ábra szerinti s/.ekvcnciájú, meghatározó cDNS tartalmú piazmidokat, míg a 2) eljárás szerinti cDNS esetében az 1. ábra szerinti szekvenciájű növekedési hormont meghatározó cDNS tartalmú piazmidokat nyerünk. A. Eljárás szarvasmarha növekedési előhormon előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerint: szarvasmarha növekedési előhormon cDNS-t tartalmazó vektort Pst I-el részlegesen emésztjük, a terméket T4 DNS polimerázzal kezeljük előbb dATP, majd dCTP, majd dTTP jelenlétében, az így kialakult terméket SÍ nukleázzal emésztjük, így tompavégű fragmenst kapunk, — eközben ptrp E30 plazmidot T4 DNS polimerázzal, majd SÍ nukleázzal kezeljük, tompavégű ptrpE30 pluzmid-fragmcnst nyerve, — mind a fenti tompavégű fragmenshez, mind a tompavégű ptrpE30 plazmid-fragmenshez szintetikus linkért ligálunk, az így létrejött termékeket Bam Hl-vel hasítjuk, a hasított termékeket egymással ligáijuk, az így létrejött terméket E. coli HBlOl-be, vagy E. coli RRI-be, vagy E. coli k 1776-ba transzformáljuk, antibiotikum rezis .tencia alapján transzformánsokat izolálunk, és a ptrpE30/GGH transzformánst kiválasztjuk, ezt megfelelő tápközegben és megfelelő körülmények között tenyésztjük, és a keletkezett előhormon-fehéqét a ferment léből izoláljuk. 5. Eljárás szarvasmarha növekedési hormon előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 2. igénypont szerinti cDNS-hez végligálással szintetikus linker szekvenciát kötünk, ugyanezt a szekvenciát kötjük T4 DNS polimerázzal, majd SÍ nukleázzal kezelt ptrpE30 plazmidhoz, mindkét terméket hasítjuk, az így létrejött termé5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
