195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
I 195 534 2 specifikus módon elhasíthatók az előbbiektől a sejten kívüli környezetben. Különösen előnyösek azok a fúziós polipeptidek, amelyeknél a homológ rész a trp vezető polipeptid egy, vagy több aminosavját és a trp E aminosav-szekvenciának (távolabbi vég) mintegy harmadát vagy ennél nagyobb részét tartalmazza. Az így kapott fúziós fehérjék igen jó stabilitással rendelkeznek az előállítás során fellépő károsító behatásokkal szemben. Az Escherichia coli K-12 törzs W3110 tna 2-trp“A102 (pGMl, ATCC 31622) felhasználható a találmány szerinti, csillapító-hiányos trp promotor-operátor rendszerek kialakításánál előnyösen alkalmazott pGMl plazmid szaporítására. Ez a baktériumtörzs a fenotípus szempontjából trp+, antranilát jelenlétében, és minimáltáptalajon tenyészthető, például 50 jug/ml antraniláttal kiegészített LB táptalajon. A trp promotor-operátor által irányított kifejeződésekhez alkalmazott összes baktériumtörzs trp represszor+ (trp R+) tulajdonságú, mint a vad típusú Escherichia coli esetén, és ez biztosítja a repressziót mindaddig, amíg heterológ termelést akarunk fenntartani. A találmány szerinti eljárás értelmében a DNS rekombinációt előnyösen az Escherichia coli K-12 294 (A-végződés, thi-. hsr-, hsm£) ATCC 31446 törzssel végezzük. E baktériumok membránjának jellemzői megkönnyítik a transzformációkat. Az említett 294 jelzésű törzzsel termelt, heterológ polipeptidet előállító plazmidokat a szokásos módon extraháljuk és oldatban tartjuk (például 10 mM trisz [trisz(hidroxi-metil)-amino-metán], 1 mM EDTA [etilén-diamino-tetraecetsav], p = 8), körülbelül -20 °C és mintegy +4 °C közötti hőmérsékleten. Másrészt, ipari körülmények között történő termeléshez előnyösebb egy ellenállóbb törzs, az Escherichia coli K-12 X-F"RV 308 strr, gal 308“ (ATCC 31608). Az Rv 308 jelzésű törzs a tápanyag szempontjából vad típusú, jól tenyészthető minimál táptalajon és az összes szükséges makromolekulát szintetizálja az ammónium- és foszfátionokat, magnéziumsókat, fémnyomokat és glukózt tartalmazó szokásos keverékekből. Miután az RV 308 jelzésű törzs tenyészetét a 294 jelzésű törzs plazmidjával transzformáltuk, a tenyészetet olyan táptalajra visszük át, amely szelektív egy, a plazmid által hordozott jellemzőre (például az antibiotikumokkal szembeni rezisztenciára), s a transzformált tenyészetet lombikban tenyésztjük tovább. Az ez utóbbiból vett alikvot részeket 10% dimetilszulfoxidos vagy glicerines oldatban (steril Wheaton-ampullákban) ..héjfagyasztásnak” vetjük alá etanolos száraz jeges fürdőben, majd —80 °C-on fagyasztjuk. Az információkat hordozó heterológ polipeptid termelésére a tenyészetből vett mintákat triptofántartalmú táptalajon tenyésztjük, a trp promotor-operátor elfojtása érdekében. Ekkor a triptofán adalékanyag nélküli rendszerben megindul a polipeptid termelése. A tenyésztés első szakaszához például LB táptalajt alkalmazhatunk [J. H. Miller. Experiments in Molecular Genetics, 433, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972], amely 1 liter vizes oldatban 10 g triptont (gyártó Bacto). 5 g élesztőkivonatot (gyártó Bacto) és 10 g nátriumkloridot tartalmaz. Előnyösen az oltóanyagot addig tenyésztjük, amig az optikai sűrűség (o.d.) értéke 10, vagy ennél nagyobb, előnyösen 20, különösen előnyösen 30 vagy ennél nagyobb nem lesz 550 nm-nél, azonban kevesebb, mint a stacionárius fázisban. A derepresszió megszüntetésére és a kifejeződés beindítására az oltóanyagot ezután olyan körülmények között tenyésztjük, ahol a sejtnek nem áll rendelkezésére triptofán adalékanyag. E tenyésztéshez alkalmas táptalaj például az M9 jelzésű [J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, .431, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972], amely a következőképpen készül. Az alábbi komponenseket 3 g kálium-dihidrogén-foszfát 6 g dinátrium-hidrogén-foszfát 0. 5 g nátrium-klorid 1 g ammónium-klorid 1 liter vízben oldjuk. Autoklávban kezeljük az oldatot, majd hozzáadjuk a következő komponenseket: 10 ml 0,01 M kalcium-klorid 1 ml 1 M magnézium-szulfát 10 ml 20%-os glukóz 1 pglml B! vitamin 40 gig/ml aminosavak („Humko hyease amino” kazein-hidrolizátum, Humko Sheffield Chemical Co., vagy „DIFCO kazein” triptofánt nem tartalmazó kazeinhidrolizátum). A heterológ polipeptid termelésének megindításához a triptofán-tartalmú táptalajon tenyésztett oltóanyagot nagyobb táptalaj-mennyiséggel hígíthatjuk, amely triptofán adalékanyagot nem tartalmaz. Például 2—10-szeresre hígíthatjuk, és a kívánt mértékig folytathatjuk a tenyésztést (célszerűen nem-stacionárius tenyésztési fázisban), majd a kívánt terméket önmagában ismert módon különítjük el elbontással, centrifugálással és tisztítással. A triptofán-hiányos tenyésztési szakaszban a sejteket célszerűen 10 feletti optikai sűrűség, előnyösen 20 feletti optikai sűrűség, különösen előnyösen 30 feletti optikai sűrűség eléréséig tenyésztjük a termék elkülönítése előtt. (Az optikai sűrűség mérését 550 nm-nél végezzük,) A következő kísérleti részben ismertetett valamennyi DNS rekombinációs kísérletet a National Institutes of Health (USA) DNS-rekombinációs kutatására vonatkozó irányelvei szerint végeztünk. 1. D-Polipeptid fúziós fehérje expressziója A kívánt polipeptideket és a trp polipeptid aminosavszckvenciájátiak egy részét összekapcsolva tartalmazó fúziós fehérjéket előnyösen az alábbiak szerint állítjuk elő. Az ismertetés során az 1—3. ábrára hivatkoznak. (A trp D polipeptidnek a polipeptidekkel összekapcsolni kívánt része a brómeiános hasításra specifikus módon érzékeny metionin alapján választható el in vitro). A) A pBRHtrp kialakítása A pGMl plazmid (ATCC 31622; az 1. ábrán az (1) jelzésű anyag) hordozza az Escherichia coli triptofán operonját. amely a ALE1413 kiiktatást tartalmazza [G. F. Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 1978, 1457—1466] és ezért olyan fúziós fehérjét termel, amely a trp vezető első hat aminosavjából, a trp E polipeptid körülbelül utolsó harmadából (ezt a továbbiakban LE' szimbólummal jelöljük), valamint a teljes trp D poli-5 i0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 66 6
