195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
1 195 534 2 összes fehérje előállítható jelentős termeléssel, akár tartalmaz a fehérje triptofánt, akár nem, A találmány szerint bármilyen kívánt ponton elhasíthatjuk a kétszálú DNS-t, még a restrikciós enzim támadási helyének távollétében is. Ez többek között olyan trp operonok létrehozásához használható, amelyekből másmilyen módon hiányzik a csillapító, mint a fentebb ismertetett esetben a mutánsok kiválasztásánál. Végül a találmány sokféle értékes közbenső termék és végtermék előállítását biztosítja, közöttük specifikus módon hasítható, heterológ-homológ fúziós fehérjéket, amelyek stabilizáltak az expresszió körülményei között fellépő lebontó hatásokkal szemben. A találmányt részletesen ismertetik a mellékelt ábrák. Az 1. és 2. ábra heterológ gének kifejezésére képes plazmidok előnyös előállítási eljárását szemlélteti. A génképzésnél fúzió történik a trp D polipeptid egy részével, és a fúziós gének később lehasíthatók. A 3. ábra homológ (trp D1) és heterológ (szomatosztatin vagy timozin alfa 1) fehérjékből összekapcsolt sejtfehérje poliakrilamidgél-szegregációs analízisének eredményét mutatja be. A4., 5. és 6. ábra heterológ génnek (emberi növekedési hormonnak) a trp promotor-operátor rendszer hatása alatt történő közvetlen kifejezésére alkalmas plazmid előállítására szolgáló eljárás egymást követő lépéseit szemlélteti. A 7. ábra a trp promotor-operátor rendszer hatására közvetlenül kifejezett, emberi növekedési hormont tartalmazó sejtfehérje poliakrilamidgél-szegregációs analízisének eredményét mutatja be. A 8., 9(a—b), és 10. ábra olyan plazmidok előállítására szolgáló, előnyös eljárás egymást követő lépéseit szemlélteti, amelyek heterológ gének (a bemutatott esetben szomatosztatin) kifejezésére alkalmasak a trp E polipeptid egy részével való fúzióval. Ezek a fúziók később felhasíthatók. A 11. ábra szomatosztatin, timozin alfa 1, emberi pro inzulin és emberi inzulin A és B komponensei termelésére szolgáló, homológ (trp E) és heterológ részből álló fúziós fehérjéket tartalmazó sejtfehérje poliakrilamidgélszegregációs analízisének eredményét mutatja be. A 12. és 13. ábra azokat az egymást követő lépéseket szemlélteti, amelyek során a 8—10. ábrákon vázolt eljárással előállított plazmidból olyan rendszert hozunk létre, amelyben más heterológ gének egymással felcscrélhetően kifejezhetők, összekapcsolva trp E polipeptid szekvenciákkal. Az ábrákon csak a kétszálú plazmid és a lineáris DNS kódoló szálát tüntettük fel a legtöbb esetben, a jobb érthetőség érdekében. Az antibiotikummal szembeni rezisztenciát kódoló géneket apR (ampicillin) és tcR (tetraciklin) jelzéssel láttuk el. A tcs jelölés olyan, a tetraciklinnel szembeni rezisztenciáért felelős gént jelent, amelyet nem szabályoz egy promotor-operátor rendszer, és így az ezt a gént tartalmazó plazmidok ennek ellenére érzékenyek lesznek tetraciklinre. Az aps jelölés olyan, ampicillinnel szembeni érzékenységet jelöl, amely az ampicillinre való érzékenységet kódoló génrész kiiktatásából ered. A plazmid promotorok és operátorok jelölése .,p” illetve „o”. Az A, T, G és C betűk az adenin, timin, guanin illetve citozin bázisokat tartalmazó nukleotidokat jelzik. Az ábrákon található egyéb jelölések jelentése a további leírásrészekből tűnik ki. | A találmány szerint előnyösen alkalmazott, általánosan hozzáférhető restrikciós endonukleázokat az alábbiakban tüntetjük fel, a megfelelő „felismerő” szekvenciákkal és a nyilakkal jelzett hasítási helyekkel együtt. 4. 4 Xbal: TCTAGA Taql: TCGA AGATCT AGCT t t 4 4 EcoRI: GAATTC HindlII: AAGCTT CTTAAG TTCGAA t t 4 4 BglII: AGATCT Hpal: GTTAAC TCTAGA CAATTG t t 4 4 Pvull GAGCTG PstI: CTGCAG GTCGAC GACGTC t f 4 BamHI: GGATCC CCTAGG t Ha a hasítási helyek külön-külön helyezkednek el az egyes ágakon, a hasítással kialakuló végek „ragadósak” lesznek, azaz újra összekapcsolhatók egymással vagy más „ragadós” végű DNS-val a Watson—Crick-féle bázispárosítással (adenin a timinhez és guanin a citozinhoz), analóg módon a csapnak a csaplyukba történő illesztésével. Néhány restrikciós enzim, például a Hpal és Pvull úgy hasít, hogy „tompa” végek képződnek. A fenti nukleotid szekvenciákat a szokásos egyezményes módon ábrázoltuk: a felső szál az információkat tartalmazó fehérjét kódoló szál, és ezen a szálon balról jobbra haladva az 5* végtől a 3' végig megyünk, azaz a közelebbi ponttól a távolabbi pontig történő átírás irányába. A „A” jelölés kiiktatást jelent. Ha például egy plazmidra való hivatkozásnál mondjuk a „AEcoRI—Xbal” jelzés szerepel, ez olyan plazmidot ír le, amelyből az EcoRI és Xbal restrikciós enzimhelyek közötti nukleotid szekvencia el lett távolítva a jelzett enzimek segítségével. Az egyszerűség kedvéért bizonyos kiiktatásokat számmal látunk el. így az eredeti pBR322 plazmidban a tetraciklinnel szembeni rezisztenciáért felelős gént megelőző EcoRI felismerési hely első bázispáijától („bp”) kezdve, „Al" a bpl-30 kiiktatását (azaz AEcoRI—HindlII) és azt jelzi, hogy ennek folytán működésképtelenné vált a tetraciklin promotor-operátor rendszer. „A2" a bp 1— 375 kiiktatását (azaz AEcoRI—BamHI) és azt jelzi, hogy nincs jelen sem a tetraciklin promotor-operátor, sem az a szerkezeti gén, amely a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kódolja. „A3” a bp3611 - 4359 kiiktatását (azaz APstl-EcoRl) és az ampicillinnel szembeni rezisztencia megszűnését jelzi. „A4” azt mutatja, hogy a bp ~900----1500 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
