195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
I 195 533 2 mivel a példában ismertetett enzim termostabilis, tovább tisztítjuk oly módon, hogy 10 mmól kalciumiont adagolunk oldatához, 80 °C hőmérsékletre melegítjük fel, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 10 percen át. A fenti eljárással az E. coli összes fehérjéje kicsapódik, és ily módon lehetővé válik az a-amiláz igen tiszta alakban, gyakorlatilag más enzim nélküli elkülönítése. Meghatároztuk az a-amiláz specificitását: aktív amilózzal és keményítővel, a hidrolízis termékei: glükóz, maltóz, és maltotrióz; ezenfelül nyomnyi mennyiségű, nagyobb molekulasúlyú vegyületek. Az enzim ciklodextrinncl szemben nem aktív. Tanulmányoztuk az enzim hőrezisztenciáját és úgy találtuk, hogy az igen magas. 0,5% amilózzal meghatározva az aktivitást, az optimális hőmérsékletet 80 °C és 90 °C között találtuk. 8% oldható keményítővel szemben az optimum 100 °C körül található. Lehetséges, hogy a leírásban Bacillus coagulans-nak nevezett mikroorganizmus ténylegesen Bacillus licheniformis. 2A. példa A pCP 2 plazmid szubklónozása a pC 194 plazmidba, és az új plazmid kifejezése Bacillus subtilis mikroorganizmusban A példában szemléltetjük azt a módszert, amivel a találmány szerinti eljárással előállított rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejezhető az E. coli-tói különböző gazdabaktériumban, nevezetesen egy Bacillus subtilis törzsben. A 2. példában megadottak szerint előállított pCP 2 plazmid 3,4 Kb nagyságú fragmenst tartalmaz, amely a B. coagulans donorból származik. A plazmidot ampicillin és tetraciklin rezisztencia jellemez, és ezenkívül két restrikciós szakaszt tartalmaz mind az Eco Rí és a Hind III enzimekkel szemben. A pCP 2 plazmidot négy fragmensre hasítjuk az Eco Rí és a Hind III enzimekkel, ligázzal kezeljük a fragmenseket, a termékkel pedig az előző példákban megadottak szerint HB 101 sejteket transzformálunk. Az új plazmidokat pCP 2,3-nak (izolálás: LB-táptalaj + 30 g/mi ampicillin) nevezzük, ezek 2,7 Kb nagy- 5 ságú fragmenst tartalmaznak a B. coagulans dezoxi-ribonukieinsavából. Ez a fragmcns aza-ami!ázt meghatározó gént tartalmazza. A pCP 2,3 plazmid az Eco RÍ és a Hind III enzimekkel szemben egyetlen támadható helyet tartalmaz, ezenkívül hordozza az ampicillin és tetra* 10 ciklinnel szembeni rezisztenciát meghatározó géneket is. A következő lépésben olyan pC 194 plazmidot szelektálunk (előállítását lásd Ehrlich S. D. Proc. Nat. Ac. Sei. 74, 1680—82 (1977)] amely replikálódik a Bacillus subtilis sejtben. A pC 194 plazmid kloramfeni- 15 kollal szembeni rezisztenciát határoz meg, és egyetlen, Hind III enzimmel támadható hellyel rendelkezik. A pCP 2,3 és a pC 194 plazmidokat Hind III enzimmel nyitjuk, keverjük a fragmenseket, és új plazmid 2q előállítására ligázzal kezeljük. Az új molekula pCH 1 jellel szerepel a leírásban, tartalmaz a-amilázt meghatározó gént, és mind kloramfenikollal, mind ampicillinnel szembeni rezisztenciát meghatároz. A kloramfenikollal szembeni rezisztencia E. coli-ban alacsonyabb mértékű. 2g Ahogy az előzőekben is végeztük, a készítménnyel F. coli HB 101 sejteket transzformálunk. Ezután egy mutánst B. subtilis törzset (QB 1133) protoplaszt-képzésre kezelünk (a törzset Steinmetz doktortól kaptuk, Institut de Recherche en Biologie 30 Moléculaire, Université Paris Cedex 05). A törzs nem rendelkezik a-amiláz-aktivitással, a protoplasztok képzését Chang és Cohen módszere szerint végezzük [Molec. Cen. Genet., 168, 111-115. (1979)]. A protoplasztokat polietilén-glikollal szabályozott transzformációs eljárás- 35 sal (Chang és Cohen, ugyanott) pCH 1 plazmiddal transzformáljuk. A protoplasztokat gazdag táptalajban 1,5 órán át inkubáljuk a plazmid sejtbe való bejutásának elősegítésére, illetve a kloramfenikollal szembeni rezisztencia 40 kifejeződésére. Ezután kloramfenikolt tartalmazó, regenerációs táptalajon szélesztjük a protoplasztokat, a táptalaj ml-I. Táblázat Az amiláz-aktivitás az eredeti B. coagulans törzsben és a rekombináns, 2. példa szerint előállított kiónokban, egység/literben* Felülúszó Periplazmatikus fér Sejtek Összes Az enzimtermelés növekedése B. coaguláns 42 — — 42 1 lambda NM 781 a Amy 1 144-— 144 3,43* E. coli CL 7002 (pCP 2) amplifikáció 230-5,700** 5,930 141,2* E. coli CL 7002 (pCP 2) egy éjszakán át tenyésztve 276,2 12,960 232 13,467 320,6* E, coli CL 7003 (lambda a Amy 1) 23 — 1,162** 1,185 26,1* * = 1 egységnyi az az enzimmennyiség, amely 1 mg/ml maltóz ekvivalenst termel percenként, 50 °C hőmérsékleten, szubsztrátként 0,5 % amilózt használva. ** = Nem használtuk az ozmotikus sokk módszerét, lízis azonban történt: ily módon a megadott érték a periplazmatikus térben és a sejtekben lévő amiláz-aktivitás összegét jelenti. 9
