195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
I 195 533 2 tőén megfelelő mennyiségű bakteriofággal fertőzzük őket, és addig folytatjuk a tenyésztést, míg a sejtek fala feloldódik, és az amiláz a táptalajba kerül. Abban az esetben, ha a vektor-gazdasejt rendszer megfelelő lambdalizogén E. coli, úgy a fertőzött gazdamikroorganizmust megfelelő mennyiségű baktériumsejt előállítására 32 °C hőmérsékleten tenyésztjük, ezt követően 42 °C hőmérsékletre emeljük a tenyészlé hőmérsékletét, és a litikus ciklus indukciójára bizonyos ideig ezen a hőmérsékleten tartjuk. Ezt követően 37 °C-ra csökkentjük a hőmérsékletet, az idegen dezoxi-rubonukleinsav amplifikálására, amely nagymennyiségű amiláztermeléssel jár együtt. A körülményektől függően oldódik fel a sejtek fala, ebben az esetben az amiláz a tenyészlébe kerül. Abban az esetben, ha a vektor több másolatot tartalmazó plazmid, például pBR 322 vagy pACYC 184 plazmid, úgy az idegen dezoxi-ribonukleinsav amplifikálódását per se (magában a sejtben) éljük el. Eljárhatunk oly módon, hogy a génsebészeti módszerekkel kapott mikroorganizmus - amely tartalmazza a plazmid-dezoxiribonukleinsavat - a sejtjeit megfelelő sűrűségig szaporítjuk, ezután kloramfenikolt adagolunk. Az antibiotikum gátolja a fehérje szintézisét, és ez megakadályozza a sejtek osztódását és az amiláz termelését; ugyanakkor lehetséges a sejten belül lévő plazmid-dezoxi-ribonukleinsav osztódása (amplifikálódása). Ezt követően elkülönítjük a sejteket a tenyészetből, és a kloramfenikol eltávolítására mossuk. Az amiláz termelésére újratenyésztjük a sejteket, természetesen a kloramfenikol nélkül, amikor nagymennyiségű amilázt kapunk. Mint minden génsebészeti munkánál, természetesen szükség van a sejtek jelzésére, amivel szelektálhatok, azaz kiválaszthatjuk az adott genetikai információt tartalmazó kiónokat. A jelen leírás során ezt keményítőt tartalmazó táptalajon végezzük, ha a-amilázt, (3-amilázt vagy glüko-amilázt kívánunk termelni. Ezután jóddal festjük a tenyészetet, az amiláz aktivitással rendelkező telepek a keményítőt tartalmazó táptalajon fehér udvarral vannak körülvéve. A következőkben megadunk egy előnyös festési módszert. Abban az esetben, ha pullulanáz aktivitást keresünk, úgy a kiónokat pullulánt tartalmazó BBL Trypticase-táptalajon szélesztjük. A továbbiakban ezt a módszert részletesen ismertetjük. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást, ismertetjük az anyagokat és a módszereket. Több módszer jól ismert a területen jártas szakemberek körében; ennek ellenére egyeseket részletesen megadunk, az érthetőség kedvéért. Donor mikroorganizmus A donor mikroorganizmus olyan baktérium, amely legalább egy amiláz (közötte természetesen a kívánt amiláz) bioszintézisére képes, előnyösen olyan amilázt termel, amely a keményítő ipari hidrolízisére alkalmas, például rezisztens a magas hőmérsékletre és a fémionmérgekre. A donor eukarióta amilázt termelő mikroorganizmus is lehet, például egy gomba vagy élesztő. A prokariótából származó dezoxi-ribonukleinsavva! azonban viszonylag egyszerűbben kísérletezhetünk; így nem eukarióta forrásból származó molekulákat használunk, leírásunk ily módon bakteriális donorra korlátozódik. Ahogy az a példákból kiderül, sikeresen használtuk a Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus és Klebsiella pneumoniae törzseket génsebészeti módon megváltoztatott mikroorganizmusok előállítására. Ezek a mikroorganizmusok hőre rezisztens a-amilázt, 0-amiláz.t és pullulanázt termelnek, sorrendben, nagymennyiségben. Ligdciós és restrikciós enzimek A munkánk során ligációs (kötő) enzimként T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt használunk, érthető módon azonban bármely más dezoxi-ribonukleinsav-kötő enzim használható. A restrikciós enzimeket a példákban adjuk meg. A restrikciós^enzimek kiválasztását természetesen jói ismert módszerekkel végezzük. A restrikciós enzimek kiválasztása úgy történik, hogy a donor mikroorganizmusból izolált dezoxi-ribonukleinsavat (donor dezoxiri! onukleinsav) különböző restrikciós enzimekkel hasítjuk, és egyet (vagy többet) választunk ki azon az alapon, hegy a dezoxi-ribonukleinsav molekulát 2-15 kilobázis nagyságú fragmensekre hasítja. Vektorok Több oka van annak, hogy a donorból elkülönített dezoxi-ribonukleinsav klónozására különösen előnyösen használhatunk lambda-fág származékokat. Ezek az okok: 1) a lambda-fág deh'ciós mutánsai lehetővé teszik különböző nagyságú idegen dezoxi-ribonukleinsav fragmensek beépítését (természetesen a specifikus lambda-molekulátói függően), és ezenkívül lehetséges az idegen dezoxiribonukleinsavat tartalmazó kiónok egyszerű azonosítása. 2) Olyan lambda-fág származékok állnak rendelkezésre. amelyek különböző restrikciós enzimek használatát teszik lehetővé; ily módon növekszik a sikeres klónozás valószínűsége. 3) Megfelelő lambda-fág származékot használva könnyen elérhető az idegen gének ampliflkáiódása (sokszorozódása). 4) Ligációt követően a rekombináns kiónok visszanyerése könnyen elvégezhető transzfekcióval vagy in vitro beépítéssel. Más, jelenleg ismeretes vektor esetén nem jelentkező előnyök miatt a jelen leírás kivitelezésekor lambda-fág származékokat és E. coli gazdasejtet használunk a donorból extrahált dczoxí-ribonuklelnsav első klónozására. A plazmiddal szemben a fág használatának további előnyei a következők: 1) Az idegen dezoxi-ribonukleinsav szakaszt tartalmazó rekombinánsok százaléka nagyobb. 2) A baktérium lizál, ily módon a sejttartalom, azaz az amiláz is, a táptalajba kerül, amikor használható a jódfestéses kimutatás. 3) A jóddal szembeni rezisztencia a fág esetén nagyobb, mint bármely élő baktérium esetén. A megfelelő plazmid kiválasztása vektorra szubklónozáskor szakember számára nem jelent nehézséget, az első kritérium természetesen az, hogy a használt restrikciós enzim számára egy, vagy korlátozott számú restrikciós helyet tartalmazzon. Munkánk során pBR 322 és pACYC 184 plazmidokat használunk. Érintetlen állapotában a pBR 322 plazmid ampicillinnc! és tctraciklinncl szembeni rezisztenciát 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
