195522. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers inzulin kiszorításos kromatográfiás tisztítására
1 195 522 2 A találmány tárgya eljárás inzulin kiszorításos kromatográfiás módszerrel történő tisztítására. Az inzulin a diabetes mellitusban szenvedők gyógyításához nélkülözhetetlen anyag. A gyógyászati készítmények általában sertés- vagy marhainzulint tartalmaznak. Az állati eredetű inzulinokba a feldolgozás során számos, így inzulin bomlástermék, inzulin-származék, inzulin prekurzor és egyéb polipeptid jellegű anyag kerül be. Ezek károsak, mert hatásukra azonos gyógyászati hatás elérésére egyre nagyobb mennyiségű inzulin-készítményt kell a betegeknek adni: fellép az úgynevezett fokozódó inzulinéhség. Ilyen szempontból a legkedvezőtlenebb hatású az inzulin prekurzorja, a proinzulin. Az inzulin-készítmények szennyezőinek eltávolítására általában gélkromatográfiás módszereket, ioncserés módszereket és ezek kombinációit alkalmazzák. Az első csoportból figyelemre méltó a nyers inzulin Sephadex G-50 (Pharmacia, Svédország) dextrán gélen 0,01 mól/! koncentrációjú sósavas eluenssel [J. Agr. Food Cliem., 19, (4), 581. (1971)] és Sephadex LH-60 (Pharmacia, Svédország) hidrofobizált dextrángélen, 65 % etilalkohol, 35% acetátpuffer (pH 7,3) elegyével végzett tisztítása (0439 sz. európai szabadalmi bejelentés). A gélkromatográfiás tisztítások közös hátránya, hogy segítségükkel az inzulinhoz közelálló molekulatömegű szennyezők nem távolíthatók el. Hatékony ioncserés tisztítást ismertet a 2 629 568 számú NSZK-beli nyilvánosságra hozatali irat, amely szerint 1%-nyi nem-ionos detergenst. 0,1 mól/1 koncentrációjú Tris puffert (pH 7) és 0,5 mól/1 nátriumkloridot tartalmazó eluenssel, DEAE Sephadex A-25 ioncserélőn (Pharmacia, Svédország) végzik az elválasztást. Jól alkalmazható a kosárcentrifugába töltött SP Sephadex C-25-ös ioncserélőt (Pharmacia, Svédország) és 0,1 mól/1 koncentrációjú, pH 8,2 Tris puffert alkalmazó. 65 %-os etilalkoholt alkalmazó eljárás (2 757 377 sz. NSZK-bcli nyilvánosságra hozatali irat) is. Az ioncserés és gélkromatográfiás tisztítási lépések kombinációját alkalmazzák a Diabetes, 17, 725, (1968) szakcikkben úgy, hogy Biogel P-30 gélen végzett előtisztítás után 7 mól/1 karbamidot és 0,01 mól/1 citrátpuffert tartalmazó pH 7.4 eluenssel DEAE-Celiulose (Pharmacia, Svédország) ioncserélőn tisztítják meg az inzulint. Bonyolult elegyek alkotóinak elválasztására általában oszlopkromatográfiát alkalmaznak. Az oszlopok frontális, eluációs és kiszorításos üzemmódban használhatók. A legelterjedtebb üzemmód — még a preparatív jellegű elválasztások esetén is — az elúció. Az clúció során az oszlopon megkötött, annak csak kis hányadát elfoglaló komponenseket a komponensnél kevésbé kötődő oldattal, az úgynevezett eluenssel mossák le az oszlopról. Az eluált minta az elúció során azonban hígul, ami a preparatív elválasztások esetén hátrányos. Kiszorításos kromatográfia esetén, melyet elsőnek az Ark. Kern. Mineral Geol. 16 (A), 1, (1943) szakcikkben írtak le az oszlopon megkötendő komponenst nálánál erősebben adszorbeálódó komponenssel szorítják le az oszlopról. Többkomponensű minta esetén a komponensek egymás utáni zónákban helyezkednek el, melyeket azonos sebességgel tol maga előtt a kiszorító anyag frontja. Ideális esetben az oszlopot elhagyó komponensek koncentrációja négyszöghullám-szerűen változik. E módszer előnye, hogy elválasztás közben az oszlop 2 jelentős hányadát foglalja el a minta, és az elválasztás során a komponensek nem hígulnak. Kimutatták [J. Chromatogr., 218, 365. (1981) és J. Chromatogr., 215, 295, (1981)]. hogy a sikeres kiszorításos kromatográfiás elválasztás feltétele az egyensúlyban lévő és állandó sebességgel haladó zónasorozat kialakulása. Ebben az esetben a komponensek koncentrációja csak anyagi minőségüktől és a munkaegyenes helyzetétől, míg a zónák szélessége az oszlopra felvitt anyag mennyiségétől függ. A kiszorításos kromatográfiás eljárást korábban csak kis molckulntömcgű, elsősorban 500-nál kisebb relatív molekulatömegíi komponensek elválasztására és tisztítására használták [Chromatogr., 218, 365, (1981)]. Ennek oka az, hogy hidrofób állófázisból (például fordított fázisú alkilezctt szilikagél töltetből) és liidroorganikus ino/.gófázisból (például metanol-víz vagy acetonitril-víz elcgyből) álló kromatográfiás fázisrendszerben a kis molekulatömegei komponensek diffúziója és anyagátadása gyors, így az elválasztás alapjául szolgáló egyensúly viszonylag gyorsan, kis sávszélességet okozva áll be. Rövidszénláncú alkil-csoportokkal alkilezett szilikagél fázist és ionpárkromatográfiás üzemmódot alkalmazva sikerült a kiszorításos kromatográfiás módszerrel elválasztható komponensek molekulatömeg határát 1200-ig kiterjeszteni [J. Chromatogr., 215, 295, (1981)]. Ily módon oktil-dodecil-dimetil-ammónium-klorid kiszorítószer vizes oldatát alkalmazva Polymixin B-típusú antibiotikumok elválasztását sikerült laboratóriumi körülmények között megoldani. Kromatográfiás eluátumok kétdimenziós gélelektroforézises vizsgálatról számolnak be a Clin. Chem., 28(4), 998-999, (1982) alatti szakcikkben. Proteinek ioncserés kromatográfiás vizsgálati módszereit ismertetik a Methods Enzymol., 104, 113—13, (1984) szakcikkben. Meglepő módon azt találtuk, hogy a nagy molekulatömegű nyers inzulin tisztítására is alkalmassá tehető a kiszorításos kromatográfia. ha úgy járunk el, hogy egy 2-10 tf % metanolt, és egy 1-3 közötti pH-jú pufferrendszert tartalmazó vizes vivőfázissal egyensúlyba hozott hidrofób, alkilezett szilikagél állófázisra a nevezett vivőfázisban oldva felvisszük a tisztítandó nyers inzulint, majd a tiszta inzulin fő tömegét 10-100 mmól/liter koncentrációban cetil-trimetil-ammóniumbromidot tartalmazó fenti vivőfázissal, és kívánt esetben a maradékát a fő tömeg eltávolításánál alkalmazottat meghaladó cetil-trimetil-ammónium-bromid-koncentrációjú fenti vivőfázissal végzett kiszorításos kromatográfiával távolítjuk el az állófázisról. Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy az igen nagy molekulatömegű, polipeptid szerkezetű inzulin, amely fordított fázisú folyadékkromatográfiás rendszerekben erős szilanofil és hidrofób kölcsönhatással kötődik az oszlophoz [J. Chromatogr., 236, ,51, (1982)], megfelelő, szilanofil és hidrofób kölcsönhatásra egyaránt képes kiszorítószert alkalmazva a gyengébben kötődő szennyezőktől megtisztítható. Találmányunk szerint a kiszorításos kromatográfiában' a stacioner állapot megbontásával csökkenthető az elválasztás időszükséglete, növelhető az erősebben kötődő komponensek koncentrációja, javítható a preparatív célból végzett kiszorításos elválasztás termelékenysége, és csökkenthető a teljesen el nem választott komponensek újbóli elválasztása előtt alkalmazandó mintakoncentrálás mértéke. (Ezt a fajta elválasztási módszert a továbbiakban gradiens 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
