195494. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikum-éterek előállítására
7 195 494 8 Na2HP04 0,316 g|l MgS04 0,112 kh2po4 0,152 CaCl2 0,038 NaHC03 2,260 FeS04.7H20 0,008 NaCl 0,375 ZnS04.7H20 0,004 KC1 0,375 CuS04.5H20 0,002 A pufferolt bendőfolyadékot 1 literes választótölcsérben tartjuk. A pufferolt bendöfolyadék anaerob jellegének és homogenitásának biztosítása céljából a folyadékon állandóan szén-dioxidot vezetünk keresztül. Az egyes fermentációkhoz 1 25 ml-es Erlenmeyer-lombikokat alkalmaz.unk. A teszt-vegyület befogadására szolgáló lombikok 0,75 g, 80% koncentrátumbó! és 20% alfaalfaszénából álló finomra őrölt keveréket tartalmaznak. A teszt-vegyület mentes kontroll befogadására szolgáló lombikok 0,82 g finomra őrölt alaptakarmányt tartalmaznak. 0,6 ml teszt-vegyületet megfelelő oldószerben oldunk, a teszt céljait szolgáló egyes lombikokhoz adunk és egy éjjelen át állni hagyjuk. Minden teszt-vegyület végső koncentrációja 50 ppm. A kontroll fermentációs lombikokhoz teszt-vegyületet nem tartalmazó oldószert adunk. Pozitív kontrollként 50 ppm Monensin szolgál. A tesztvegyületet tartalmazó lombikokhoz 60 g pufferolt bendőfolyadékot és a kontroli-lombikokhoz 65,9 g pufferolt bendőfolyadékot adunk. Az összes komponenst tartalmazó lombikokat egyirányú gázszeleppel ellátott zárral lezárjuk; az egyirányú gázszelepen keresztól a fermentációból képződő gázok eltávozhatnak. Minden kontroli-lombikból 6 ml mintát veszünk (,,0- idő"-próba). A lombikokat rázogatás közben (percenként 120 mozgatás) 4 órán át inkubáljuk. A bendőfolyadékot 25x125 ml-es üvegcsövecskékbe öntjük és a durva anyag leválasztása céljából jégfürdőn 15 percen át állni hagyjuk. 13 ml-es polikarbonát-centrifugacsövecskékben (Autoclear IEC0)2 ml 25 tömeg/ térfogat %-os metafoszforsavat (J. T. Baker) 6 mlbendőfolyadékkal elegyítünk. A csövecskéket lezárjuk és tartalmukat alaposan összekeverjük. A csövecskéket 30 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 10 percen keresztül, percenkénti 16 000 fordulat mellett „874 angle head” IEC B20 centrifugában centrifugáljuk. Ezután 4 ml felül levő anyaghoz 1 ml belső standardot (0,25% 2-metil-valeriánsav, Aldrich Chemical Company) adunk. A kapott elegyet „Swinnex” szűrő és 5 ml-es fecskendő segítségével 0,22 mikronos millipórusú szűrőn átszűrjük. A szűrletet 3 ml-es üvegcsövecskékben fogjuk fel, amelyeket rászorított gumimembránnal zárunk le. Minden különálló fermentációt reprezentáló csövecske illékony zsírsav tartalmát gázfolyadékkromatográfiás úton határozzuk meg. Minden csövecskét az oszlopon keresztül történő háromszori egymásutáni átfecskendezéssel analizálunk. Az acetát-, propionát-, izobutirát-, n-butirát-, izovalerát- és n-valerát-koncentrációt folyékony zsírsavak standard-oldataival kapott elemzésekkel való összehasonlítással, belső standardizációs módszer felhasználásával számítjuk ki. A teszt-vegyület aktivitását a propionát (C3), illetve acetát (C2) és n-butirát (C4) termelés relatív változásával határozzuk meg, azaz meghatározzuk az illékony zsírsavak Ca C2 + C4 mólarányát. A fenti hányadosnak a teszt-vegyület hatására a kontrolihoz viszonyított növekedését a pozitív kontrollal kapott növekedés százalékának tekintjük. Az eredményeket a IV. Táblázatban foglaljuk össze. IV. Táblázat A teszt-vegyületek jelenlétében (50 ppm) végzett fermentációk során előállított illékony zsírsavak mólaránya Teszt-vegyület C3/C2+C4 Kontroll- Monenillékony hoz vi- sínhez zsírsavak szonyított viszomólará- növeke- nyitott nya dés növek. % 20 Kezeletlen kontroll Monensin X-14868A n-propiléter X-14868A etiléter 25 X-14868A n-butiléter X-14868A etilén-glikol-éter X-14868A n-hexil- 30 -éter X-14868A n-pentiléter X-14868A butilén-glikol-éter 35 0,356 — — 0,549 0,193 100,0 0,497 0,141 73,1 0,541 0,185 95,9 0,502 0,146 75,6 0,574 0,218 113,0 0,549 0,193 100,0 0,482 0,126 65,3 0,174 99,4 A savformában levő éterek sóit a poliéter-vegyületek kémiájában jól ismert módszerekkel állíthatjuk elő. így pl. a szabad savat a megfelelő bázis vagy só oldatá- 40 val mossuk. A sók előállításához gyógyászatilag alkalmas bázisokat alkalmazhatunk, pl. alkálifém-bázisokat (mint pl. nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot, litium-hidroxidot stb.), alkáliföldfém-bázisokat (pl. kalcium-hidroxidot, bárium-hidroxidot stb.), vagy ammó- 45 nium-hidroxidot. A poliéter-vegyületekkel gyógyászatilag alkalmas sókat képező szerves bázisként pl. kis szénatomszámú alkil-aminokat és primer, szekunder éstercier hidroxi (kis szénatomszámú alkil)-aminokat (pl. etil-amint, izopro- 50 pil-amint, dietil-amint, metil-n-butil-amint, etanol-amint vagy dietanol-amint) alkalmazhatunk. Sóképző aminként különösen előnyösen N-metil-glükamint alkalmazhatunk. Az N-metil-glükaminnal képezett sók ugyanis jó vízoldhatóságuk révén parente- 55 rális felhasználásra különösen értékesek. A találmányunk szerinti eljárással előállítható vegyületeket kérődzők takarmányhasznosítási koefficiensének javítása céljából előnyösen kb. 0,003—0,75 mg/kgI nap mennyiségben adagolhatjuk. A legkielégítőbb ered- 60 ményeket kb. 0,03—0,075 mg/kg/nap dózisokkal kapjuk. Találmányunk további részleteit az alábbi példákkal ismertetjük anélkül, hogy az oltalmi kört a példákra 65 korlátoznánk. 5
