195253. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid csoportba tartozó antibiotikumok előállítására mikrobiológiai úton és eljárás ezen antibiotikumokat tartalmzó állatgyógyászati készítmények előállítására
7 195253 8 tűk továbbá, hogy maleinsav és dimetil-szulfoxid elősegíti a tilozin-komplex bioszintézisét. A táptalaj pufferkapacitásának növelésére kalcium-karbonátot alkalmazunk. A fermentáció hőmérséklete 25—40°C kő- 5 zött változhat. Legelőnyösebbnek találtuk a 28—30°C-on végzett fermentációt. A keverés fordulatszáma a fermentor geometriájának függvényében percenként 200-400 között változhat. A levegőztetés előnyösen 1/1 v/v percenként. A fermentáció során keletkező antibiotikumok (tilozin A + minor komponensek) összes hatékonyságát Staphylococcus epidermidis tesztorganizmussal állapítjuk meg agar- 15 diffúziós módszerrel (J.S. Simpson: Analytical Microbiology, Acad. Press, New York, 1963, 87—124. oldal) tilozin A standard anyagra vonatkoztatva. 160—180 órás fermentációs idő alatt a 20 fermentlé összaktivitása kb. 2500—3900 E/ml/t ér el. (1 E = 1 pg/ml tilozin A hatékonysága). A fermentlében jelenlévő antibiotikum-komplexnek mintegy 85%-át teszi ki a tilozin A. 25 A tilozin-komplexet előnyösen adszorpciós és extrakciós eljárásokkal nyerhetjük ki a Streptomyces tendae fermentléből. A tilozin-komplex a fermentlé szűrletéből 30 adszorpciós kromatográfiával előnyösen úgy különíthető el, hogy a szűrt fermentléből a tilozin típusú antibiotikumokat makropórusos polisztirol-, illetve akrilészter-típusú gyantákon (Diaion HP-20, Mitsubishi Co. Tokió; 35 Amberlite XAD-8, Rohm and Haas, Philadelphia; Servachrom XAD-7, Serva Feinbiochemica, Heidelberg) kötjük meg. A gyantáról az adszorbeált antibiotikumokat előnyösen aceton-ecetsav-víz eleggyel oldjuk le. Az 40 eluátumként kapott tisztított antibiotikum oldatból semlegesítés után az acetont desztillációval eltávolítjuk és a kapott vizes sűrítményt kevés, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, célszerűen etil-acetáttal kivonjuk, 45 majd a kivonat vákuumban történő besűrítése után petroléter hozzáadásával választjuk le a tilozin-komplexet. A tilozin-komplex a fermentlé szűrletéből ismert módon (3 178 341 számú amerikai 50 egyesült államokbeli szabadalmi leírás) vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel végzett extrakcióval is elkülöníthető. Az extrakció előtt a fermentlé szűrletének pH-ját enyhén lúgosra, célszerűen 8,5 értékre állítjuk. Az extrakció 55 kivitelezését megnehezíti az erős emulzió-képződés, mely klórozott szénhidrogének, szerves észterek, vízzel nem elegyedő szerves ketonok és szerves alkoholok extrahálószerként való alkalmazása esetén egyaránt megfigyel- 00 hető. A szerves oldószeres kivonat bepárlásával tilozin-komplexet tartalmazó nyerstermékhez jutunk, mely célszerűen kristályosítással tisztítható. A tilozin-komplex komponenseinek egymás- 6g tói való elválasztását oszlopkromatográfiás és preparatív vékonyréteg-kromatográfiás módszerekkel végeztük. Az izolált antibiotikumok szerkezetét IR, 'H NMR és tömegspektroszkópiás vizsgálatokkal igazoltuk. A tilozin-komplexből és komponenseiből savaddíciós sók képezhetők ásványi savakkal, például sósavval, foszforsavval és szerves savakkal, például borkősavval. Előállításuk során úgy járunk el, hogy az antibiotikum bázist szerves oldószerben, például acetonban vagy dietiléterben feloldjuk és az oldathoz a kívánt szervetlen vagy szerves savat ekvivalens mennyiségben hozzáadjuk. A képződött só csapadék formájában kiválik az oldatból. A találmány szerinti eljárással előállított tilozint és sóit az állatgyógyászatban és az állattenyésztésben alkalmazzuk. Ezen célokra szolgáló készítményt úgy állítjuk elő, hogy a tilozint vagy annak savaddíciós sóit, különösen foszfát, illetve tartarát sóját önmagában vagy egyéb, az állatgyógyászatban és állattakarmányozásban használatos antibiotikummal, továbbá adalékanyagokkal, segéd és/vagy hígító és tartósítószerekkel, valamint adott esetben tápanyagokkal együtt, ismert módon, állatgyógyászati és/ /vagy állattakarmányozási célokra szolgáló orális készítménnyé alakítjuk. E készítményeket célszerű az állatok táplálékába, illetve itatóvízébe keverve adagolni. Állatgyógyászati célból a tilozint injekció formájában is adhatjuk az állatoknak. A találmány kivitelezését az alábbi példákkal szemléltetjük: 1. példa A Streptomyces tendae (MNG 00274) spóráival beoltjuk a következő összetételű ferdeagar táptalajt: vízoldható keményítő 20 g kálium-nitrát 1 g dikálium-hidrogén-foszfát 0,5 g magnézium-szulfát-víz ( 1/7) 0,5 g nátrium-klorid 0,5 g vas(II)-szulfát-víz (1/7) 0,01 g Bacto agar 15 g desztillált viz 1000 ml-re. A ferdeagar tenyészetet 8 napig inkubáljuk 37°C-on, majd a spórákat desztillált vízzel lemossuk. 10®—107/ml spórával steril körülmények között 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml steril táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő: kukoricalekvár 7 g glükóz 20 g ammónium-nitrát 6 g kalcium-karbonát 5 g csapvíz 1000 ml-re. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyészetet síkrázógépen (260fordulat/perc, 10 cm kitérés) 32°C-on 2 napig rázatjuk. Az így kapott tenyészet 4-4 ml-ével 50 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100—100 ml táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő: 5
