195249. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs alkaloidok, főként ergokrisztin parazita úton való előállítására
195249 A találmány tárgya eljárás anyarozs alkaloidok, főként ergokrisztin parazita úton való előállítására, Claviceps purpurea törzs új variánsával. Az anyarozs alkaloidok előállításának két eltérő módja ismeretes; a termesztett drog extrakcióján alapuló eljárások, illetve a steril fermentációs alkaloidtermelés Claviceps törzsekkel. A steril fermentációs alkaloidtermelésre ismeretesek realizált eljárások (150631, 151724; 152239, 164816 számú magyar szabadalmi leírások), ennek ellenére a drogtermesztés nem vesztette el jelentőségét s a világ peptida 1 ka loid termelésének jelentős hányada mindinkább a különböző alkaloidféleségekre dúsított drogot használja fel. Különösen érvényes ez az ergotamin és az ergokrisztin termelését illetően. Az ergolénvázas alkaloidokat termelő Claviceps purpurea törzs előállítása több korábbi szabadalomnak is tárgya, amelyekben változó módszerekkel igyekeztek magasabb hozamú törzsekhez jutni. így a 232648 számú szovjet szabadalom olyan eljárást ismertet, amelyben az ergotoxin előállítás céljára spóramérettel és telepmorfológiával jellemezhető Claviceps purpurea törzset állítottak elő. A 154035 számú magyar szabadalmi leírás eljárása szerint speciális táptalajon, a telep színe alapján lehet ergotoxin termelésre képes törzseket előállítani. 176003 számú magyar szabadalmi leírás eljárást ismertet ergokrisztint termelő, rozsra virulens Claviceps purpurea törzs spóratenyészetének előállítására. A 185.715 számú magyar szabadalmi leírás eljárást ismertet anyarozs alkaolidok, főleg ergokrisztin parazita úton való előállítására. A találmány célkitűzése olyan eljárás kidolgozása az ergokrisztin parazita utón való előállítására, amelyben a parazita Claviceps purpurea törzs új variánsa — mesterséges táptalajokon, agar felületen és süllyesztett tenyészetben jól spórázik;- spórái jól tartósíthatok; — spórái életképesek és virulensek, újra tápközegbe juttatva 90-95%-ban kicsíráznak és a rozsra juttatva azt fertőzik, — magas droghozamot biztosít; — a drog főalkaloidként 99,5%-ban ergokrisztint tartalmaz, és a főalkaloidokon kívül csak jelentéktelen szennyezést. 1 A találmány célkitűzése magasabb ergokrisztin tartalmú törzsvariáns előállítása. Az új variáns előállítását az ivaros és szelekciós nemesítési mód alkalmazásával végeztük. 5 Kiindulási anyag a 185. 715 számússzabada-lmi leírásban szereplő OKI-nál 00233 szám alatt 1982. május 27-én deponált, főleg ergokrisztint termelő törzs droganyaga. A drogból küllemileg megfelelő, simaíelü- 10 letű, nagyméretű szkleróciumokat választottunk ki. Ezeket nedves homokba ágyaztuk és 6 hétig 0-5°C-on tartottuk, majd a felületet steril vízzel lemosva Petri-csészében nedvesen tartott steril szivacsba helyeztük. A sztró- 15 mák kialakulása és kifejlődése után kiválasztottuk a legfejlettebbeket, amelynek felületén a peritéciumok kitüremkedési mikroszkópi vizsgálat alapján a legnagyobbak voltak. Ezeket 10%-os maláta-agar táptalaj fölött, 20 steril körülmények között, hőráhatással aszkospórák kilövelésére késztettük. A kilövelt aszkospórákból kialakult telepeket a telep fejlődési üteme, spóratermelő képessége, morfológiája alapján szelektáltuk és izoláltuk. 25 Az izolált telepek spóráit szubmersz tenyészetben felszaporítottuk és izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótüs fertőzésével. Az izolációt 20 m2-es rozssáv biztosította. A kifejlődött szkleróciu- . 30 mókát vékonyrétegkromatográfiás analitikai vizsgálatok alapján szelektáltuk, az ergokrisztin tartalom és a mellékalkaloid szennyezés alapján. A legamagasabb ergokrisztin tartalmú, mellékalkaloid szennyezéstől mentes 35 szkleróciumokból vegetatív szaporítással, steril szkleróciummetszetek maláta-agar táptalajra való oltásával felületi tenyészeteket készítettünk. Ezekből a felületi tenyészetekből a konidiumokat a példában leírt folyékony táp- 40 talajba oltva felszaporítottuk. A legtöbb konidiumot termelő tenyészetek spóráit izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótűs fertőzésével, ahol a droghozam és a drog minőségi jellemzői szerint szelektáltuk. A szelekciós nemesítési munkát további 3 éven át folytattuk. Az új törzsvariánst, melynek intézeti jelzése Bkl(i/2) 1984. 1984. december 19-én az Országos Közegészségügyi Intézetben 00321 50 szám alatt deponálták. Az új törzsvariáns a kiindulási tenyészethez képest a spórafermentációban és a drogtermesztésben az alábbi eredményeket adta: 2 Új törzsvariáns Régi törzs Intézeti jelzése OKI deponálási száma OKI deponálási ideje Fermentlé spóraszáma /spóra/mm3/ Tartósított oltóspóra csiraképessége % Virulencia % Bkl/i/2/1984. 00321 1984.dec.19. 5-6 x 105 95-99 85-90 Bkl/i/1/1980. 00233 1982.máj.27. 5-6 x 105 95-99 80-90 2
