195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
17 195248 I. Táblázat 18 A higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztencia Sej ttípus A táptalaj antibiotikum koncentracioja 0 jjg/ml 200 jjg/ml 400X jug/ml E. coli K12 + — _ E. coli K12 BE827/ /pKC203 + + + E. coli K12 BE827 +E. coli K12 BE827/ /pKC214 N/T + N/T E. coli K12 BE827/pKC215 N/T + N/T Mouse Ltk +N/T Mouse Ltk“/pKC214 + + + Mouse Ltk“/pKC215 + + x = A Mouse Ltk’ "/pKC214 és a Mouse Ltk“/pKC215 sej-tek nemcsak 400 jug/ml antibiotikum jelenlétében replikálódtak, de túlélték az 1000 jug/ml-nél nagyobb koncentrációjú antibiotikum hatását is. II. Táblázat • A G418 antibiotikummal szembeni rezisztencia Sej ttipus A táptalaj antibiotikum koncentrációj a 0 jug/ml 75 jug/ml 75 jug/ml 500 jug/ml E. coli Kl2/pKC203 + + + N/T Mouse Ltk+ +Mouse Ltk-/pKC214 + + + + Mouse Ltk~/pKC215 + + +-7. példa A pGDl és pGD2 plazmidok és az E. coli K12 BE827/pGDl és az E. coli K12 BE827/ /pGD2 transzformánsok előállítása A pLG669 plazmid előállítását Guarente és Ptashne írja le (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 78, 2199, 1981), a plazmid a citokróm C génben egyetlen BamHI restrikciós helyet tartalmaz. A pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII fragmensét az alábbiak szerint ebbe a helybe klónozzuk, amikor lehetővé válik a higromicin B rezisztenciát meghatározó gén kifejeződése. A beépítést könnyen véghezvihetjük, mivel a BglII fragmensek az 5’-végen GÁTC-szekvenciát tartalmaznak, és ez azonos a BamHI fragmensek 5’-végein lévő szekvenciával. így a BglII és a BamHI fragmensek összekapcsolhatók, és közvetlen ligációt követően rekombinánsokat kapunk. A pGDl és a pGD2 plazmidokat, továbbá az E. coli K12 BE827/pGDl és az E. coli KI2 BE827/pGD2 transzformánsokat lényegében a 3. példában megadottak szerint el-10 járva állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy . a pSV5 gpt plazmid helyett az egyetlen BamHI restrikciós hellyel rendelkező pLG669 plazmidot használjuk fel. A BglII fragmens orientációjától függően kétorientációjú plazmidokat kapunk. A pGDl plazmid olyan rekombináns 50 plazmid termék, amelyben az Sail restrikciós hely közelebb esik az ura génhez. A pGD2 olyan plazmid, amelynek orientációja fordított. 55 8. példa A Saccharomyces cerevisiae/pGDl előállítása A Saccharomyces cerevisiae élesztőt a hagyományos módon növesztjük 1% élesztőkivonatot és 2% bakto-peptont tartalmazó tápg_ talajon, ismert mikrobiológiai módszerrel. A pGDl plazmid transzformációját az élesztőbe Hinnen és munkatársai szerint végezzük (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 75, 1929, 1978). A transzformánsok szelektálására letális mennyiségű higromicin B antibiotikumot 65 adunk a tenyésztő táptalajhoz.
