195226. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs alkaloidok, főként alfa-ergokriptin parazita úton való előállítására
195226 2 1 A találmány tárgya eljárás anyarozs alkaloidok, főként alfa-ergokripton parazita úton való előállítására. Claviceps purpurea törzs új variánsával. A korábbiakban az ergokriptin előállítását kizárólag szaprofita módon, folyadékkultúrában, speciális táptalajon a szükséges feltételek biztosítása mellett végezték. Parazita körülmények között, főleg alfa-ergokriptint termelő Claviceps purpurea törzs 1 korábbiakban nem létezett. Ismeretes volt, olyan vegyes alkaloidtartalmú parazita anyarozs törzs, melynek spóráival fertőzött rozson képződött szklerócium alfa- és béta-ergokriptirit, ergokornint és ergozint együttesen termel. 1984.V.9-.én megadott 185 700 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás az első, mely eljárást ismertet anyarozs alkaloidok, főként alfa-ergokriptin parazita úton való előállítására. A találmány célkitűzése olyan eljárás kidolgozása az alfa-ergokriptin parazita úton való előállítására, amelyben a parazita Claviceps purpurea törzs új variánsa — mesterséges táptalajon, agar felületen és süllyesztett tenyészetben jól spórázik; — spórái jól tartósíthatok; — spórái életképesek és virulensek, — magas droghozamot biztosít, — a drog főalkaloidként 90%-ban alfa-ergokriptint tartalmaz. A találmány célkitűzése magasabb alfaergokriptin tartalmú törzsvariáns előállítása. Az új variáns előállítását az ivaros és szelekciós nemesítési mód alkalmazásával végeztük. Kiindulási anyag a 185.700 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban szereplő OKI-nál 00219. szám alatt, 1981. november 19-én deponált, főleg alfa-ergokriptint termelő törzs droganyaga. A drogból küllemileg megfelelő, simafelületű, nagyméretű szkleróciumokat választottunk ki. Ezeket nedves homokba ágyaztuk és 6 hétig 0—5°C-on tartottuk, majd a felületet steril vízzel lemosva Petri-csészében nedvesen tartott steril szivacsra helyeztük. A sztómák kialakulása és kifejlődése után kiválasztottuk a legfej- 5 lettebbeket, amelynek felületén a peritéciumok kitüremkedései mikroszkópi vizsgálat alapján a legnagyobbak voltak. Ezeket 10%-os maláta-agar táptalaj fölött, steril körülmények között, hőráhatással aszkospórák kilövelésére 10 késztettük. A kilövellt aszkospórákból kialakult telepeket a telep fejlődési üteme, spóratermelő képessége, morfológiája alapján szelektáltuk és izoláltuk. Az izolált telepek spóráit szubmersz tenyészetben felszaporítottuk 15 és izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótűs fertőzésével. Az izolációt 20 m2-es rozssáv biztosította. A kifejlődött szkleróciumokat vékonyréteg-kromatográfiás analitikai vizsgálatok alapján szelek- 20 táltuk, az alfa-ergokriptin tartalom és a mellékalkaloid szennyezés alapján. A legmagasabb alfa-ergokriptin tartalmú, mellékalkaloid szennyezéstől mentes szkleróciumokból vegetatív szaporítással, steril szkleróciummetsze- 25 tek maláta-agar táptalajra való oltásával felületi tenyészeteket készítettünk. Ezekből a felületi tenyészetekből a konidiumokat a példában leírt folyékony táptalajba oltva felszaporítottuk. A legtöbb konidiumot terme- 30 lő tenyészeteket választottuk ki az életképesség figyelembevételével. A kiválasztott tenyészetek spóráit izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótűs fertőzésével, ahol a droghozam és a drog minő- 35 ségi jellemzői szerint szelektáltuk. A szelekciós nemesítési munkát további 3 éven át folytattuk. Az új törzsvariánst, melynek intézeti jelzése Bk5/1/412. 1985. február 19-én az Or- 40 szágos Közegészségügyi Intézetben a 00322 szám alatt deponáltuk. Az új törzs a kiindulási tenyészethez képest a spórafermentációban és a drogtermesztésben az alábbi eredményeket adta: Új törzs Régi törzs Intézeti jelzése Bk5/1/412/85 Bk5/208/81 OKI deponálási száma 00322 00219 OKI deponálási ideje 1985.11.19. 1981.XI.9. Fermentlé spóraszáma 5 (spóra/mm3) 5-6 x 105 5-6 x 10 Tartósított oltóspóra csíraképessége % 95-99 95-98 Virulencia % 90-95 90-95 Ezerszkleróciumtömeg tg) 150-170 165 Terméseredmény (kg/ha) 350-420 300-350 Alfa-ergokriptin tartalom mg/g 6,5 4,5 Alfa-ergokriptin hozam g/ha 2502 1463 Mellékalkaloid 1,5%o ergozin 5-10% béta-ergokriptin, Zsírosolaj tartalom % 19-21 ergozin 19 2
