195211. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5-alkil-1-fenil- 2-(piperazino-alkil)-pirazolin-3-on-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
195211 reakciót az aminok alkilezésére ismert szokásos módszerekkel végezhetjük el. Az (I) általános képletű vegyületek és savaddíciós sóik értékes farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek és különösen kifejezett antiallergiás hatást mutatnak. Ezek a vegyületek kedvező hatásprofillal, jó elviselhetőséggel és csekély toxicitással tűnnek ki. Az (I) általános képletű vegyületek az antigénekkel előidézett allergiás reakciókra kifejtett gátló hatásuk mellett endogén közvetítőszerek (pl. hisztamin és szerotonin) által előidézett allergiás bőr-reakciókkal szemben is kifejezetten hatásosak és az endogén közvetítő anyagoknak a hízósejtekből történő, allergiás reakciókhoz vezető felszabadulását gátolják. Ezenkívül az (I) általános képletű vegyületek ödémagátló hatást is mutatnak. Az antiallergiás és ödémaellenes hatást farmakológiai standard-tesztekkel igazoljuk. A vegyületek pl. az alábbiakban leírt PCA teszt (passzív kutáns anafilaxis) patkányon specifikus gátló hatást mutatnak. A perifériális aníihisztamin- és antiszerotonin-hatások ugyanebben a tesztben a bőr hisztamin vagy szerotonin által indukált anafilaktoid reakcióinak gátlásával is bizonyítható. A hisztaminnak a hízósejtekből anafilaxikusan előidézett felszabadulására kifejtett gátló hatását izolált peritoneális hízósejteken in vitro is igazoljuk. A teszt módszerek leírása 1. Akut toxicitás A 8 napos akut toxicitást hím egereken (testtömeg 18—22 g) egyszeri i.p. adagolás után határozzuk meg. A mortalitást 8 napon át jegyezzük. Az eredményekből az LD50 értéket — azaz az állatok 50%át elpusztító dózist — kiszámítjuk. 2. Passzív kutáns anafilaxis (PCA) gátlásának meghatározása és a hisztamin, valamint szerotonin által indukált anafilaktoid kutáns reakciók gátlásának mérése A teszt során felhasznált IgE-ben dús antiovoalbumin-szérum készítéséhez Lehrer és tsai [J. Immunoi. 116, (1976) 178—182.) és Pauwels és tsai (Ann. Immunol. 230C (1979), 49.58)] módszerével Spraque-Dawley patkányokat 1 mg ovoalbumin és 1 ml Bordetella-pertussis szuszpenzió (Vaxicoq* Merieux 3-1010 mikroorganizmus (ml) i.p. befecskendezésével szenzibilizálunk. Az állatok 20 nap elteltével ugyanilyen módon adalékot nem tartalmazó 10 mg ovoalbumin injekciót kapnak. Az állatokat 4 nap múlva elvéreztetjük és a vért centrifugáljuk. A kapott antiszérumot —20°C-on tároljuk és Goose és tsai módszerével beállítjuk [Immunology 16 (1968) 749—760.]. ( A passzív kután anafilaxis gátlása és a hisztamin, valamint szerotonin által indukált anafilaktoid kutáns reakció gátlásának meghatározását [Naunyn-Schmiedeberg’s Archi-9 vés of Pharmacology 316 (1981), 186—189.] módszerével a következőképpen végezzük el: Az ovoalbuminnal szemben passzív szenzibil izá 1 áshoz hím Spraque-Dawley patká1 nyokat (testtömeg: 150—165 g) használunk; 0,05 ml 1:2,5 hígítású fiziológiás nátrium-klorid-oldatban készült IgE-ben dús antiovoalbumin szérumot intradermálisan a-z állatok hátának borotvált részeibe fecskendezünk. A patkányok érzékenyítése után 24 óra múlva orálisan adagoljuk a teszt-vegyület oldatát. A kontroll csoport állatai hatóanyagmentes oldószert kapnak. A hisztamin- és szerotonin-indukált anafilaktoid bőrrekció kiváltásához az állatokba 30 perccel később a hát másik borotvált helyére 40 pg hisztamin 0,05 ml fiziológiás nátrium-klorid-oldattal képezett oldatát és a hát egy harmadik borotvált helyére 1 pg szerotonin 0,05 ml fiziológiás nátrium-klorid-oldattal képezett oldatát fecskendezzük intradermálisan. Ezután az anáfilaktikus reakció kiváltása céljából az állatokba azonnal 1,25 mg (A ~ ~8 mg/kg) ovoalbumint és 4 mg (-Û- ~ ~ 26,4 mg/kg) kék színezék 0,5 ml foszfáttal pufferolt fiziológiai nátrium-klorid-oldattal képezett oldatát fecskendezzük i.v. Az állatokat 30 perc múlva leöljük, bőrüket eltávolítjuk és az egyes kék foltokban levő színezék mennyiségét külön-külön meghatározzuk [Mordelet-Danbrine és tsai (Therapie 29 (1974), 851—862.)]. A színezéket az egyes foltokból 2,5 ml dimetil-formamiddal 37°C-os hőmérsékleten 4 napon át extraháljuk és az extrakciós oldatban levő színezék mennyiségét spektrofotometriás méréssel meghatározzuk. ED50 értéknek a teszt-vegyület azon dózisát tekintjük, amely a színezőanyag koncentrációt a kontroli-csoporthoz viszonyítva 50%-kal csökkenti. 3. Hisztaminnak patkány peritoneális hízósejtekből anafilaktikus módon történő felszabadítására kifejtett gátló hatás, in vitro kísérletben A peritoneális hízósejtek kinyerése céljából Spraque-Dawley patkányokat éter-belélegeztetéssel leölünk és az állatok hasüregébe azonnal a légzés-megszűnés fellépése után 15 ml hideg foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldatban készített emberi szérumalbumin-oldatot (1 mg/ml) fecskendezünk, majd peritoneális folyadékot veszünk, a hízósejteket ebből centrifugálással elválasztjuk, foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk és a szuszpenziót 5xl05/ml hízósejt koncentrációra állítjuk be. A hízósejt-szuszpenziót 100 pl-es részletekbe osztva reagens csövecskékbe mérjük be és mindegyik mintát passzív szenzibilizálás céljából IgE-ben dús antiovoalbumin szérum 1:10 hígítású fiziológiás nátrium-klorid-oldattal készült oldatával (100 pl) elegyítünk (utóbbi oldatot a korábbiakban megadott módon állítjuk elő) és 30 percen át 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
