195005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban
1 195005 2 A találmány tárgya kvantitatív hemoglobin meghatározási eljárás biológiai mintákban, és az ilyen eljárás végrehajtására alkalmas berendezés. Közelebbről a találmány tárgya vizsgálati módszer és berendezés a hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban, úgy, hogy a hemoglobin nem fluoreszkáló hem részét fluoreszkáló poiíirinné alakítjuk, és mérjük annak fluoreszcenciáját. Ez a vizsgálati módszer különösen jól alkalmazható olyan biológiai minták, mint például a széklet és vizelet esetén. Különböző gyors vizsgálati módszerek ismeretesek a hemoglobin jelenlétének és mennyiségének meghatározására biológiai anyagokban, igy pl. székletben. Ezeket a vizsgálati módszereket általánosan alkalmazzák az orvosi gyakorlatban, mint a béltumorok elsődleges kimutatási módját. A becslések szerint több mint egy millió ilyen vizsgálatot hajtanak végre az Amerikai Egyesült Államokban, minden évben. Annak ellenére, hogy ezek a vizsgálatok nem adnak kvantitatív eredményeket, és a hibás vizsgálati eredmények igen nagy személyes és anyagi károkat okoznak, és annak ellenére, hogy a jelenleg ismeretes vizsgálati módszerek jelentős mennyiségű hamis pozitív és hamis negatív eredményi adnak, továbbra is használják őket, mivel más módszer nem ismeretes. A székletben levő hemoglobin kimutatására szolgáló jelenleg alkalmazott vizsgálati módszerek nem foglalják magukban a hemoglobin hem részének porfirinné való átalakítását és annak fluoreszcenciájának mérését; a jelenleg alkalmazott vizsgálati módszerek indirekt jellegűek, és a hemoglobin peroxidázszerű (pszeudoperoxidáz) aktivitásán alapulnak. Ezekben a vizsgálatokban színtelen leuko színezékeket alkalmaznak, amelyek hemoglobin jelenlétében egy megfelelő peroxid hozzáadása után elszíneződnek. Ezeknek a vizsgálatoknak azonban vannak bizonyos korlátáik. Először is számos tényező miatt — például a specifikusság hiánya miatt és amiatt, hogy a reaktivitást gyakran gátolják vagy befolyásolják olyan anyagok, mint a vas vagy az aszkorbinsav, vagy a hemoglobin molekula változásai — igen gyakran kapnak hamis pozitív és hamis negatív eredményeket. Másodszor, a szokásos vizsgálatok eredményeinek értelmezése gyakran nehéz, mert az eredményeket csak úgy adják meg, hogy a mintában van-e vagy nincs hemoglobin. Ezen felül az egyes vizsgálati módszerek érzékenysége közötti különbségek következtében, egymáshoz viszonyítva esetenként 20- ■szoros mennyiségű székletet kell alkalmazni. Ennek a fent említett specifikusság hiánynak, valamint a színárnyalatok közötti különbség megítéléséből adódó szubjektivitás következtében a vizsgálati módszerek al2 kalmazhatósága korlátozott. Ezek következtében a klinikai és laboratóriumi módszerek közül a vér meghatározása biológiai mintákban egyik olyan ritka kivétel, amely kvantitatív módon nem hajtható végre. Bár még nem áll rendelkezésre olyan kvantitatív módszer a székletben vagy vizeletben levő hemoglobin kimutatására, amely a hem protoporfirinné alakításán alapul, számos vizsgálatot végeztek ezzel kapcsolatosan, így például G. R. Morrison tanulmányában, amelynek címe: Fluorometríc Microdetermination of Heme Protein (Anal. Chem., 37, 1124—1126, /1965/) egy módszert ismertet a hem protein mérésére állati szövetekben, amely szerint a hemet porfirinné alakítják oxálsav alkalmazásával, majd a hem tartalmat fluoreszcenciás elemzéssel határozták meg. Ezzel a módszerrel azonban bizonyos koncentráció fölött a hemoglobin szintet nem tudták meghatározni. A Morrison által leírt körülmények között ugyanis a nagyobb mennyiségű hemoglobint tartalmazó székletmintákat néhány ezerszeresre kellett volna hígítani. Az ilyen nagy hígítás nem megfelelő a nagymennyiségű, sorozatban végzendő vizsgálathoz. Szükség van tehát egy olyan kvantitatív vizsgálati módszerre és a megfelelő berendezésekre, amelyekkel ezek a vizsgálatok végrehajthatók, továbbá egy olyan készülékre, amely alkalmas a vizsgálati minta összegyűjtésére és előkészítésére, amelyek segítségével a biológiai mintákban, mint például a székletben vagy a vizeletben úgy határozható meg a hemoglobin mennyisége, hogy a hamis pozitív és hamis negatív eredményeket gyakorlatilag kiküszöböljük vagy jelentősen csökkentsük, és amely módszer könynyen alkalmazható nagyszámú vizsgálat elvégzésére. A találmány szerinti eljárás alkalmazható laboratóriumi méretekben és automatizált eljárásként is. Az általunk kifejlesztett készülék alkalmas a székletminták összegyűjtésére és előkészítésére a laboratóriumi és az automatizált eljárás során is. A találmány szerinti vizsgálati módszer specifikusnak bizonyult a hem vegyületek - re, mint például a hemoglobinra, beleértve a biológiai minta teljes protohem tartalmát is, mentes a mintában levő egyéb anyagok elsősorban a székletben, gyomorsavban, vagy vizeletben előforduló egyéb vegyületek zavaró hatásától, különösen érzékeny, kvantitatív elemzésre alkalmas 0,02 pg/ml hemoglobin koncentrációtól több, mint 1500 pg/ml hemoglobin koncentrációig, és nem befolyásolják olyan vegyületek, mint a vas, az aszkorbinsav, a sósav, az aszpirin vagy az alkohol, amelyekről ismeretes, hogy zavarnak bizonyos leuko színezék vizsgálatokat. A találmány tárgya eljárás hemoglobin kvantitatív meghatározására széklet-, vizelet, ill. gyomornedv mintákban, oly módon, hogy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
