194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
194938 26 25 11. Táblázat Fragmens Méret Vektor Rekombináns plazmid Felhasználás ai BamHI-Pstl 1, 4kb M13mp10 mKTH1285 Szűrő bi BamHI-Pstl 1,4kb M13mp11 mKTH1286 Szűrő a2 Pstl-PstI 0,8kb M13mp1C mKTH1291 Szűrő a2 Pstl-PstI 0,8kb M13mp1C mKTH1292 Szűrő a3 Pstl-PstI 0,9kb M13mp1C mKTH1288 Szűrő a3 Pstl-PstI 0,9kb M13mp1C mKTH1289 Szűrő bi Pstl-PstI 1,7kb pBR322 pKTH1281 Jelzett vizsgáló minta b2 Pstl-PstI 1,5kb pBR322 pKTHI284 Jelzett vizsgáló minta b.) Nukleinsav-reagensek sorozata érzékenységének bemutatása humán 11. papillómavírushoz, szendvics-hibridizálási módszert alkalmazva A nukleinsav-fragmensek sorozatának ér- 25 zékenységét úgy vizsgáljuk meg, amint ezt az lb. példában leírtuk, olyan szűrőket alkalmazva, amelyek mindegyike 1011 molekula mKTH1285, mKTH1286 (a,) DNS-t, és mKTH 1291, mKTH1292 (a2) DNS-t, valamint mKTH 1288, mKTH1289 (a3) DNS-t tartalmaz. A tanulmányozandó minta a HPV11 genomja, és a 11. táblázatban felsorolt, 32P-veI jelzett vizsgáló mintákat alkalmazzuk 108 cpm/g fajlagos aktivitással. 25 Az eredményeket a 12. táblázatban mutatjuk be. Az eredmények szerint a nukleinsav-reagensek sorozata mintegy 3—4-szer olyan érzékeny, mint az egyedi folyamatos reagenspáf. ' 40 12. Táblázat Minta molekula/ vizsgálat 0 5 -105 106 5 > 10 6 107 Hibridizált radioaktivitás 45 (b)-vel, mint vizsgáló mintával bi b2 bi, b2 50 31 35 72 42 50 J 3ÏÏÏ ‘ 65 72 482 55 351 365 1818 735 783 4025 bi 350000 cpm/vizsgálat b2 350000 cpm/vizsgálat bi, b2 700000 cpm/vizsgálat A pozitivítás alsó határa 60 cpm, amikor a vizsgáló minta b,, vagy b2, és 150 cpm, amikor b,, b2. c.) Humán 11. papillomavirus diagnosztikája nukleinsav-reagensek sorozatával, szendvics-hibridizálást alkalmazva A HPV11 reagensek fajlagosságát vizsgáljuk meg 6., 11., 16., és 18. HPV típusok rekombináns DNS-eit használva mintaként. 16. és 18. HPV-vel nem látható keresztreakció a vizsgált koncentrációtartományban. 107 6. HPV DNS molekula a háttérnél több, mint kétszeres hibridizálási jelet mutat (kimutathatósági határ), ezért pozitívnak tekintjük. A humán embrió fibroblaszttal (HEF), mint mintával kapott eredmények a vizsgálati háttérrel hasonlíthatók össze (13. táblázat). A klinikai tanulmányokhoz vélt HPV fertőzés miatt nyomon követett csoporthoz tartozó nőktől veszünk mintákat. Méhnyaki kenetet veszünk egymás utáni lekaparással két műanyag spatulával, és a sejteket foszfáttal pufferolt, gentamicint tartalmazó fiziológiás sóoldatban (PBS) szuszpendáljuk. A sejteket kétszer mossuk PBS-ben végül 0,2 ml TE pufferban szuszpendáljuk (10 mmól/1 trisz-HCl, pH 7,5; 1 mmól/1 EDTA). Klinikai mintákat szuszpendálunk 1% SDS-t és 0,2 mól/1 NaOH-t tartalmazó oldatban, mechanikusan nyírjuk, 5 percen át forraljuk, és semlegesítjük ekvimoláris menynyiségű ecetsavval, és hozzáadjuk a sorozat-keverékhez. A hibridizálási vizsgálatban alkalmazott reagensek azok, amelyeket a 11. táblázatban felsoroltunk. Egyébként a hibridizálási vizsgálatokat úgy hajtjuk végre, amint ezt az lb. példában leírtuk. A 13. táblázat 6 mintából kapott eredményeket mutat be, amelyeket 11. HPV-re vizsgáltunk. Ezen kívül minden vizsgálatban lizált humán embrió fibroblaszt (HEF) 10 mintájának sorozata is benne van. Ezek egyike sem pozitív. öt minta pozitív a találmány szerinti nukleinsav-reagensek sorozatával. A pont folt (dot blot) hibridizálási vizsgálat, amelyet referencia-módszerként alkalmazunk, ezek közül csak hármat mutat ki. 14
