194916. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a táplálkozást szelektíven gátló újtípusú hatóanyag előállítására
194916 lag teljesen tiszta szupernatáns folyadékot nem kapunk. Ezt a folyadékot egy 5,90 cm méretű Sephadex G—15 oszlopon kromatograíáljuk, majd 0,1 mólos ammónium-acetát-pufíer-oldattal (pH = 6,6) eluálunk. Az 500 és 600 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A liofilizált maradékot 10 ml desztillált vízben oldjuk,és egy 2,5X90 cm méretű Bio-Gel P—2 géloszlopra visszük. Az oszlopot desztillált vízzel eluáljuk, és a 130 és 180 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 30 mg nyers, sómentes szatietin-D-t kapunk, sárgásfehér por alakjában. b.) 100 mg fenti módon kapott nyerstermékből 0,1 M trisz-hidroklorid, pH: 8,2 értékű pufferoldattal 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk szobahőmérsékleten rázogatással vagy keveréssel. Az így kapott, kissé vagy gyengén opálos oldathoz 10 mg tripszint * és egyidejűleg 10 mg kimotripszint adunk, majd az elegyet jól felkeverjük. Ezután a még kissé csapadékos elegyet 37°C-os fürdőbe helyezzük és időnként felrázzuk, illetve felkeverjük. 5 óra elteltével újabb mennyiségű enzimet, nevezetesen 5 mg tripszint és 5 mg kimotripszint adunk az elegyhez, és folytatjuk a 37°C-on történő inkubálást további 19 órán át, azaz összesen 24 óráig inkubáljuk a reakcíóelegyet. Az emésztés befejezése után az elegyet 0°C és +5°C közé nűtjük, és hozzáadunk 0,1 tf./tf.%, azaz 2 ml 55 tömeg/tí.% hideg -f 5°C körüli triklór-ecetsavat, majd az elegyet összerázzuk és lefagyasztva egy éjjelen át, de legalább 1 óráig 0°C és 5°C között állni hagyjuk. Ezután a kissé zavaros, esetenként csapadékos elegyet 15— 20 000 g-vel 25 percig a fent említett hőmérsékleten ultracentrifugáljuk. A tiszta felülúszót ezután szobahőmérsékleten egy 5,0X45 cm méretű Bio-Gel P—2 géloszlopra visszük, és az oszlopot desztillált vízzel eluáljuk. A 250 és 320 ml - közötti fraks ciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 62 mg hófehér, sómentes szatietin-D-t kapunk, amelynek b iológiai aktivitása 50— * 100 Sz.E./mg. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható, új hatóanyag elkülönítésére vérszérumból, azzal jellemezve, hogy a vérszérumot 50000 molekulatömegig átengedő ultraszűrésnek vetjük alá, a szűrletet 0,01—0,1- -szeresére bepároljuk, és a kapott koncentrátumból az oldhatatlan részt eltávolítjuk, majd a folyadékfázishoz 0°C és 10°C közötti hőmérsékleten 5—25 tömeg/tf.%, célszerűen 9—11 tömeg/tf.% koncentrációig triklór-ecetsavat adunk, a kicsapódott fehérjéket eltávolítjuk, a kapott oldatot 4 000 molekulatömeg alatti kizárási térfogatú gélen kro-7 2 lap niatografáljuk, 6,0—7,0 pH-tartományú oldattil eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk, majd 3000— 4000 molekulatömeg alatti kizárási térfogatú gélen újból kromatografáljuk, vízzel eluáf\a frakcionáljuk, az aktív frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk, a liofilizált frakciókat 8,1—8,2 pH-tartományú vizes pufferben oldjuk, az oldathoz a liofilizált termék össztömege 0,01—0,2-szeresének megfelelő menynyiségü tripszint és ugyanannyi kimotripszint adunk, az elegyet 36—39°C hőmérsékleten 20—30 órán át, előnyösen időszakos keverés mellett, emésztésnek vetjük alá, az emésztés során az első 2—10 óra elmúltával az elegyhez további, az eredeti enzimmennyiség felének megfelelő mennyiségű tripszint és kimotripszint adunk, majd a reakcióelegyhez 0°C és I0°C közötti hőmérsékleten 4—6 tömeg/tf.%, célszerűen 5 tömeg/tf.% koncentrációig triklór-ecetsavat adunk, az elegyet — 15°C és 5°C közötti hőmérsékleten 1—24 órán keresztül állni hagyjuk, az oldhatatlan részt eltávolítjuk, a reakcióelegyet 3000—4000 molekulatömeg alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, desztillált vízzel eluálva frakcionáljuk, és a biológiailag aktív frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vérszérum ultraszűrését síkmembránon végezzük. 3. Az I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vérszérum ultraszürését oszlopon végezzük. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás során az oldhatatlan részek és/vagy a kicsapódott fehérjék eltávolítását ultracentrifugálással vagy szűréssel végezzük. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 6,0—7,0 pH-tartományú eluáló oldatként 0,1 mólos ammónium-acetát-oldatot használunk. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6,0—7,0 pH-tartományú oldattal végzett eluálást követően a biológiailag aktív frakciók koncentrálását liofilizálással vagy vákuumbepárlással végezzük. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 8,1—8,2 pH-tartományú vizes pufferként 0,1 mólos 2-amino-2-hidroxi-metil-l,3-propándiol-hidrogén-kloridot használunk. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a liofilizált termék összsúlya egy tized súlynak megfelelő tripszint és ugyanannyi kimotripszint adunk az oldathoz. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az emésztést 37—38°C hőmérsékleten 24 órán át végezzük. 8 2 ábra 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C rajz, 5
