194913. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 6-os helyzetben aromás amino-karbonsavat tartalmazó új gonadoliberin-származékok és e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

194913

ben előállított Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 pentapeptidet feloldunk 10 ml dimetil-formamidban, és az oldatot -10°C-ra hűtjük. Ezután keverés közben hozzáadunk 0,34 ml 6 n sósavat, majd 37,7 mg nátrium-nitrit tömény vizes oldatát csepegtetjük hozzá. 5 perc elteltével hozzáadjuk 377 mg (0,5 mmól) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(TFÁ)2 pentapeptid 1 ml dimetil-formamidban készült -10°C-os oldatát. A reakcióelegyet 2 órán át 0°C-on keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni. Másnap vákuumban bepároljuk. A visszamaradt, nyers dekapeptidet Sephadex G-25 oszlopon (2 X 95 cm) megoszlási kromatográfiával butanol : propanol : ecetsav : víz (15 : 1 : :4:20) elegyében tisztítjuk. A frakciók anyagtartalmát vékonyréteg-kromatográfiával, illetve UV abszorpció mérésével vizsgáljuk. A dekapeptidet tartalmazó frakciót liofilizáljuk, majd ezt a műveletet híg ecetsavból megismételjük.

Termelés: 323 mg (52%)

Rf=0,31; Rf=0,49; R|=0,62 Aminosav-analízis: Ser 0,91; Glu 1,03;

Pro 0,97; Gly 1,10;

Leu 1,00; Tyr 0,97;

His 1,05; Trp 0,87;

Mab 0,90; Arg 1,11

4. példa

[Aa6]-gonadoliberin előállítása

Molekulasúly: 1244,39

a) Szintézis

A vegyületet a szilárdfázisú peptidszintézis általánosan alkalmazott módszerével (Merrifield, R.B.,J.Am.Chem.Soc.85,2149- -2151 (1963)) állítjuk elő.

0,75 g (0,3 mmol) benzhidrilamint.HÇl gyantát (0,4 mmol/g, Pierce) 2 órán át duzzasztunk diklór-metánban, majd az aminosavakkal történő acilezés során a következő ciklust ismételjük:

13

Lépés

Reagens, művelet

Keverési idő

(perc)

1.

CH2C12, mosás háromszor

1

2.

33% TFA és 67% CH2C12

elegye

1

3.

33% TFA és 67% CH2C12

elegye

25

4.

CH2C12, mosás háromszor

1

5.

CHCI3, mosás kétszer

1

6.

10% TEA és 90% CHCI3

elegye, mosás kétszer

2

7.

CHCI3, mosás kétszer

1

8.

Etanol, mosás kétszer

1

9.

CH2C12, mosás kétszer

1

10.

3 ekv. Boc-áminosav

CH2C12-DMF

60 - változó

elegyében oldva, 3 ekv.

DCC v. DIC CH2Cl9-ben oldva

11.

CH2C12, mosás kétszer

1

12.

Etanol, mosás kétszer

1

Minden lépés után ninhi-drintesztet végzünk (Kaiser, E. et al., Anal. Biochem. 34, 595--598 (1970)), amennyiben szabad aminocsoportot mutatunk ki, a ciklust az 5. sortól megismételjük. Az utolsó lépés után a Glp-His(Tos) -Trp-Ser(oBzl) -Tyr (oBzl) -Aa-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly peptidgyanta súlya: Termelés: (AW): 344 mg (65%)

(M védett peptid: 1764,92)

b) Hidrogén-fluoridos hasítás

A védőcsoportok eltávolítását és a peptid lehasítását a gyantáról egy lépésben végezzük, folyékony vízmentes hidrogén-fluoriddal (Sakakibara, S. et al., Bull. Soc. Japan 40, 2164-2167 (1967)). Az előző lépésben nyert peptidgyantához 5 ml anizolt, 100 mg ditiotreitet adunk, majd 20 ml HF-ot kondenzálunk az elegyhez, és 0°C-on keverjük 1 órán át. Ezt követően a HF-ot N2-áram segítségével eltávolítjuk, a maradékot abszolút éterben szuszpendáljuk, majd szűrjük. A szilárd maradékot 50%-os ecetsavval mossuk, és a szűrletet 37°C on bepároljuk. Az így kapott dekapeptid.HF- sót (371 mg) közvetlenül gélkromatográfiának vetjük alá.

ç) Gélkromatográfia

Az előző pontban kapott anyag tisztítását Sephadex G-25 oszlopon (2,5 X 100 cm) végezzük, eluensként 20%-os ecetsavat alkalmazva. Az elválást 280 nm-nél mért UV-elnyeléssel és TLC-val követjük. A dekapeptidnek megfelelő frakciókat gyűjtjük és liofilizáljuk.

Termelés: 202 mg (54%)

d) Preparatív HPLC

Ci8-szilikagél LRP-1 (13-24 pm) (Whatman) preparatív HPLC oszlopot (2,5 X 45 cm) alkalmazunk. Az egyensúly kialakítását 15% metanol és 85% 20%-os ecetsav keverékével végezzük. Az egyensúly beállta után ebben az elegyben oldva visszük fel 202 mg gétkromatográfiával tisztított anyagot. Az elúciót először 15% metanol — 85% 20%-os ecetsav és 25% metanol — 75% 20%-os ecetsav lineáris gradiensével végezzük, majd 40%-os metanol — 60% 20%-os ecetsavval folytatjuk, végül 80% metanol — 20% 20%-os ecetsavval fejezzük be. A folyássebesség 2 ml/perc, nyomás 3,5X105-Pa. A frakciókat 280 nm-nél detektáljuk, tartalmukat TLC-val ellenőrizzük. A végtermékként kapott tiszta [Aa6] -gonadoliberin súlya liofilizálás után 123 mg (61,0%). Op. 185-192°C

[a]l°— -63,2° (c=l, 0,1 n ecetsav)

R)=0,17

Aminosav-analízis: Ser 0,92; Glu 1,03;

Pro 1,1; Gly 0,97;

Leu 1,00; Tyr 0,95;

His 1,08; Trp 0,83;

Aa 0,90; Arg 1,05

5.-6. példa

A 4. példában ismertetett eljárást alkalmazva állítjuk elő a következő vegyületeket:

14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

8