194867. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tromboxán-szintetáz-gátlók előállítására
194867 sül. Ezenfelül kimutatták, hogy a plazma tronv boxán-szintje jelentősen nő Imidazol TxA2~ -szintetáz inhibitorok alkalmazása az endotoxin-kezelés előtt kísérleti állatoknál csökkenti a sokk tüneteit és jelentősen növeli a túlélési rátát (Prostaglandins and Medicine 4,215(1980); Circulation Res 46, 854 (1980). Az (I) általános képletű vegyületek hatását a tromboxán-szintetáz, a prosztaciklin-szintetáz és a ciklooxigenáz enzimre a következő In vitro enzimvizsgálatokkal határozzuk meg: 1. Ciklooxigenáz Kos-ondóhólyagból izolált mikroszómákat (Biochemistry 10,2372 (1971)) arachidonsavval inkubálva (100 mik romól, 1 perc, 22 °C) PGH2- -t állítunk elő, és a reakciókeverék alikvotjait 37 “C-on Krebs-bikarbonát puffer áramába [amely anlagonisták (Nature 218, 1135(1968)), és indometacin (Brit. J, Pharmacol. 45, 451 (1972)) keverékét tartalmazza] fecskendeztük. E folyadékáramot csavarvonal alakúra vágott nyúlaorta-csíkra bocsátjuk rá (Nature 223, 29 (1969)) Egy vegyület enzimgátló képességét úgy határozzuk meg, hogy megmérjük a PGH2- -okozta izometrikus tenzió fokozódását a vizsgálandó vegyület távollétében, majd az enzimet a vizsgálandó vegyülettel 5 percig előinkubálva, és a kapott értékeket összevetjük (Agents and Actions //, 274 (1981)). 2 Prosziaciklin (PCI2) szintetáz Sertés-aorta mikroszómákat (Nature 263, 663 (1976)) a fenti 1 pont szerint nyert PGH2- vel inkubálunk (30 másodperc, 22 C) és a reakciót 5 térfogat etanollal leállítjuk. A PGÍ2-kópződést stabil bomlástermékének, a 6- keto—PGFia nak a mérése útján határozzuk meg specifikus radio immunreakció alkalmazásával. A PGI2 képződés teljesen meggátolható, ha az enzimet a szelektív PGI2 szintetáz inhibitorral, 15 hidroperoxi-arachidonsavval előinkubáljuk (Prostaglandins 12, 715 (1976). A vizsgálandó vegyületet az enzimmel 5 percig előínkubáljuk és mérjük a PGI2 (6-keto- PGFia) képződést gátló képességét. 3 Tromboxán Az (TxAz)-szintetáz Emberi vérlemezke-mikroszómákkal előkezelt indometacint (Science 193, 163 (1976)) PGH2 vei (az 1 pont szerint előállítva) inkubálunk (2 perc, 0 C) és a reakciót 5 térfogat etanollal leállítjuk A TxA2 képződést stabil TxB2 metabolitjának képződését mérve határozzuk meg specifikus radioimmunreakció segítségével A vizsgálandó vegyületet az enzimmel 5 percig előinkubáljuk és a tromboxán-szintetázt gátló képességét a TxA2 (TxB2) képződés csökkenésének a mérése útján határozzuk meg. Az ilyen módon tesztelt (I) általános képletű vegyületekröl kimutattuk, hogy képesek a tromboxán szintetáz enzim szelektív gátlására. A fentieken kívül leírtak egy in vitro próbát is az emberi vérlemezke-aggregáció-gátlás mérésére és ennek alapján előre megjósolható a klinikai trombózisellenes hatékonyság (Lan cet(ii) 1223(1974); J Exp Med 126,171 (1967)) 9 A klinikailag hatásos aszpirin és szulfinpirazon in vitro egyaránt gátló hatást fejt ki e próbában különféle aggregáló anyagokkal szemben Állatokon végzett számos in vivo próbát is leírtak a trombózisellenes szerek értékelésére. Patrono és munkatársai módszerét alkalmaztuk a TxB2 képződésének a vizsgálatára, melynek során a szerrel való kezelés előtt és után a teljes vérből mintát veszünk az állatoktól. Röviden a próbát úgy hajtjuk végre, hogy a vérmintákat üvegcsövekben gyűjtjük és 37 C-on megalvadni hagyjuk A szérumot centrifu gálással választjuk el és a mintákat -40 “C-on tároljuk a TxB2 meghatározásáig, amikor is az etanollal fehórjementesített mintákat megfelelő hígítás után radioimmunreakcióval (RIA) ele mezzük. E technikát használjuk a vizsgálandó vegyületekkel narkotizált nyulakon végzett kísérletekben az intravénás hatékonyság megáF lapítása céljából: Narkotizált nyulak Hím „New Zealand” fehér nyulakat (2,6- -5,6 kg) nátrium-pentabarbitonnal (30 mg per kg iv.), majd uretánnal (500 mg per kg íp.) narkotizálunk. A légcső kanülálása után egy nyaki verőérbe katért vezetünk be vérminták gyűjtése céljából. A katétert nyílt állapotban tartjuk steril fiziológiás sóoldat lassú infúziójával (0,2 ml per perc). Kontroll nyaki verőérmintákat 30 és 5 perccel a vizsgálandó vegyület vagy a hordo zó (0,9%-os konyhasóoldat, 0,2 ml per kg) alkalmazása előtt veszünk egy széli fülvénából Három csoport nyulat használunk. Az első csoport 0,03 mg/kg, majd 1 óra múlva újabb 0,1 mg/kg vizsgálandó vegyületet kap. Hasonlóan a második csoport 0,3 mg/kg, majd 1 óra múlva 1 mg/kg vizsgálandó vegyületet kap. A harmadik csoport hordozót kap, amit 1 óra múlva további hordozó-injekció követ. A nyaki verőérből mindegyik dózis beadása után 15 és 45 perc múlva vérmintákat veszünk. Mindegyik időpontban 1 ml-es vérmintákat üvegkémcsőbe mérünk be véralvadásgátló anyag nélkül a TxB2 meghatározásához. Az utóbbi vizsgálathoz a vérmintát megalvadni hagyjuk 2 óráig 37 °C-on inkubálva (előkísérletek alapján így mérhető a legnagyobb TxB2- képződés) és a szérumot centrifugálással elválasztjuk. A szérummintákból a TxB2 mérést radioimmunreakcióval (RIA) határozzuk meg etanollal való fehérjementesítós és Isogel trisz-pufferrel való hígítás után. Arachidonsav intravénás injekciója vérlemezke-összetapadást és tüdőembóliát okozva nyúlnál halált okoz. A klinikailag hatásos aszpi rin (Agents and Actions 1, 481 (1977)) és szül finpirazon (Pharmacology 14, 522(1976)) meg védi a nyulat az injekció halálos hatásától. A szulfinpirazonról azt is kimutatták, hogy pat kánynál in vivo gátolja a vérlemezke-aggregációt a testből kivezetett hasi aorta-kacsban (Thromb. Diathes. Haem. 30, 138 (1973)). E vegyületek orálisan alkalmazhatók a ve gyület egységdózisát kötőanyagokkal, mint ku korícakeményítővel, kalcium-karbonáttal, di 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
