194741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás NMR felvételhez használható kontrasztanyagok előállítására
sa a SUV-tól PBS-ben duzzasztott Sephadex G-50 oszlopokon keresztüli átpréseléssel történt, az anyagot 3 ml-es műanyag fecskendő szárába töltöttük és előcentrifugáltuk. A vezikulaoldat a fecskendő csúcsába került, a centrifugálás során képződő eluátumot megfelelően elhelyezett üvegcsőbe gyűjtöttük. A vezikuláknak az oszlopoktól való elválasztására 300 y\ PBS-t használtunk fel. Az eljárást háromszor teljesen megismételtük, hogy a szabad reagens maradék koncentrációja minimális legyen és kicserélődjön PBS-re. A végtermékben a vezikula koncentrációt az oldat alikvot részének szcintillációs számlálóval történő vizsgálatából határoztuk meg, standard keveréket is felhasználva. A közepes vezikulaméretet Model 200 típusú (Nicomp Instruments) lézeres részecskemérővel határoztuk meg. Minden egyes kísérletben a részecskeméretet 600±100 Á-nek találtuk. Az NMR relaxációs idők mérése az alábbi módon történik. Ha másképp nincs jelezve, a T, és T2 mérése 20 MHz-es impulzus NMR spektrométerrel (IBM PC/20 gyártmány) lett elvégezve, mely IBM PC mikroszámítógéphez kapcsolódott. Z, az úgynevezett inversion-recovery módszerrel (lásd Farrar, T.C., Becker, E.D., Impulzus és Fourier-transzformációs NMR, 1971, Academic Press, New York, című könyvét), míg T2 a Carr- Purcell szekvenciák alapján (lásd Carr, H. Y., Purcell, E.H., Diffúzió hatása a szabad precesszióra NMR kísérletekben, Phys. Rév., 1954, 94, 630-633. oldal, című cikkét), a Meiboom és Gill által javasolt módosításoknak megfelelően (Meiboom, S., Gill D., Módosított spin-echo módszer a mag-relaxációs idők mérésére című cikke, Rév. Sei. Instrum., 1958, 29, 688-691. oldal) került meghatározásra. A számítógépe automatikusan, legkisebb négyzetes értelemben exponenciálisokat illesztett a mérési adatokra. A közölt T, és T2 adatok 38 °C-os mérési hőmérsékletnek felelnek meg. A T, értékek kísérleti bizonytalansága ±10% reprodukálhatóságuk ±5%. A T2 értékek általában ±20%-on belül pontosak, és ±5%-ra reprodukálhatók. Ez a pontosság elegendő ahhoz, hogy a kívánt hatásokat világosan megfigyelhessük. Néhány T, értéket a 10 MHz-en működő Praxis II típusú NMR spektrométeren határoztunk meg, 25 °C mérési hőmérsékleten. A llatkisérletek Az EMT6 tumoros szövet [lásd Laboratory Animal Research, Vol. 27. No. 5, 831-851 (1977), és Cancer Research, Vol. 39 (1979)] hímnemű Balb/c egerek horpaszának bőre alá lett beültetve, majd 10 napig növekedhetett. A tizedik napon az egereket intravénásán beinjektáltuk 200 /vl vezikulaoldattal vagy kontrollpufferrel. Az egereket meghatározott időközönként elpusztítottuk, a tumorokat felboncoltuk. Néhány kísérletben a májat és a lépet is boncoltuk. A szövetet PBS-ben öblítettük, könnyedén leitattuk, megmértük, majd légmentesen zárható műanyag zsákokba csomagoltuk. Az NMR relaxációs méréseket a boncolást követő fél órán belül végeztük el, a vízvesztés és az emiatt megváltozó T, és T2 idők hibájának csökkentése céljából. Az ábrák jelentése az alábbi: Az 1. ábra a longitudinális relaxációs időt ábrázolja a paramágneses ionok koncentrációjának függvényében. A szabványoldatok alikvot részeit PBS pufferhez adagoltuk. A T, méréseket 10 MHz-en végeztük a 90°-90° módszerrel. A mérési hőmérséklet 25 °C volt. Az 5 4 Er-EDTA koncentráció skálája nM egységekben, míg a Mn-citráté M egységekbe került megadásra. A 2. ábra l/T,-nek a hozzáadott különböző formájú C d-ionoktól való függését ábrázolja. A szabványoldatok alikvot részeit vízhez (Gd/citrát esetén) vagy FBS- hez (Gd/DTPA és vezikulába zárványosított Gd/DTP4 esetén) adagoltuk, a jelzett ion teljes koncentrációjának meghatározása céljából. A 3. ábra a paramágneses ionkomplexek koncentrációjának hatását ábrázolja az 1/T,, illetve 1/T2 értékekre. A DSPC/koleszterin vezikulák PBS-be ágyazott növekvő koncentrációjú Gd-DTPA-val lettek előállítva. A lipid (vezikula) koncentrációk 8,3 mg/ml teljes lipid végső koncentrációval megegyező FBS-re lettek beállí va. A 4. ábra mutatja az egérszövetek és daganatok relaxációs sebességeit. A Balb/c egerekbe beinjekcióztunk 200 //1-t a DSPC/koleszterin vezikulákban zárványosított 200 mmól Gd-DTPA-ból (10 mg/ml lipid) (Gd vez.), a DSPC/koleszterinben zárványosított 200 mmól La-DTPA-ból (La vez.), 2,0 mmólt a PBS-ben o dott Gd-DTPA-ból (Gd puffer) vagy PBS-t (puffer). In óra elteltével az egereket megöltük és a szöveteket felboncoltuk. A közölt relaxációs idők legalább három állat átlagát mutatják. Az 5. ábra mutatja a hozzáadott poli-L-lizin hatását a Gd-DTPA oldatok relaxációs sebességére. A poli-L-lizin szárazon mért alikvotjait 2,0 ml 2,0 mmól Gd- ETPA-t tartalmazó vízben oldottuk. A T, és T2 idők mérése a szövegben leírtak szerint történt. A 6. ábra egérdaganatok 1/T, idejét mutatja. 200 irM Gd-DTPA-t tartalmazó, 10 mg/ml-es koncentrációjú lipid vezikula preparátumok 200 //1-jét injektáltuk olyan Balb/c egerek farokvénájába, melyek 10 napos, implantált daganattal rendelkeztek. Meghatározott időközönként öltük meg az egereket, a boncolás után azonnal mértük a daganatok T, idejét. A kontroll egyedi ;kbe vagy nem injekcióztunk semmit (0) vagy 200 //I PTS-ben oldott 2,0 mM Gd-DTPA-t injekcióztunk (□). Az ábrán a három kísérletet egyszerre tüntetjük fel. A 0 és □ adatok esetén minden pont az egyedi daganatokra jellemző T, értéket adja meg. A a adatok esetén 2 vagy 3 T, értéket mértünk véletlenszerűen az egyedi daganatra. A következőkben, részletesebben referálva az ábrákat, a jelen találmány alkalmazásával elérhető javított eredményeket diszkutáljuk. Az 1. ábrán az Er-EDTA és a Mn-citrát oldatok relaxációs sebességeit láthatjuk. A 10 MHz-en és 25 °C-on mért 1/T, értékeket ábrázolté k az ionkoncentráció függvényében. Az ábra egér lágy szöveteire vonatkozó átlagos 1/T, értékeket tüntet fel. A koncentráció skála az Er-EDTA-ra millimólos, míg a Mn-citrátra mikromólos. 18 mM Er-EDTA komplex hozzáadása a PBS oldathoz 2,4 s~'-gyel növeli az egérszövet 1/T, értékét. Ugyanezen relaxációs sebesség érhető el csupán 0,17 mM Mn-citrát komplex hozzáadásával is. Tehát a Mn gyenge komplexe mintegy százszor hatásosabb a relaxáció növelésében, mint az erősen kötött Er-EDTA, ami jól mutatja a Mn(II)ion lényegesen erősebb relaxációs erejét, akárcsak a Mn-nak a vízhez való fokozottabb hozzáférését. A 2. ábrán a Gd(III) relaxációs hatásait tanulmányozhatjuk. 20 MHz-en 1 mM Gd-citrát hozzáadása a H G 1/T, értékét 8,1 s~’-gyel növeli meg. DTPA-hoz kötődve az ion fele ekkora relaxációs hatással rendel6 194 741 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
