194496. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Marek-kór elleni élő vakcina előállítására
5 194496 6 MDV-vakcinák, amelyeket a 35., szövettenyészeten végzett passzálás után használunk, kielégítő védelmet nyújtanak. A vakcina azonban MD-elváltozásokat okoz az SPF RIR csirkékben, amelyek nagyon fogékonyak MD-re. A CVI-988 MDV-klónok egész sorának patogén tulajdonságait tanulmányoztuk SPF RIR csirkékben. Ezeket a tanulmányokat azért kezdeményeztük, mert korábban kimutatták, hogy a CVI-988 DEF5, „C” MDV-klón és a CVI-988 DEF97 „E” MDV-klón nem patogén SPF RIR csirkékre. A CVI-988 DEF51 „C” MDV-klónnal, a CVI-988 CEF59 „C” MDV-klónnal és a CVI-988 CEF65 „C” MDV-klónnal végzett ártalmatlansági tanulmányokat az I. és II. példákban mutatjuk be. Ezek azt mutatják, hogy a találmány szerinti „C” vírus-klón nem patogén RIR csirkékre. A CVI-988 CEFW „A” MDV-klónnal, CVI-988 CEF62 „B” MDV- klónnal, CVI-988 CEF67 „C” MDV-klónnal és CVI-988 CEF59 „C” kiónnal (ahol az utolsó kettő „C” tarfoltból ered, amelyet 49. DEF passzálásból gyűjtöttünk, de kissé eltérő sejtpasszálási előélettel) végrehajtott ártalmatlansági tanulmányokat a III. példában mutatjuk be. Ezek a kísérletek azt demonstrálják, hogy két csirkében, ahol az egyik „A” klónnal, a másik „C”’ kiónnal volt inokulálva. Marék-kórra fajlagos szövettani elváltozásokat figyelünk meg. Az „A ” antigén lépcsőzetes redukciója Az „A” antigént eredetileg mind a sejtkivonatokban, mind az MD-vírussal fertőzött sejtek tenyészfolyadékában kimutatták immundiffúziós elemzéssel [J. Gén. Virol. 4, 557-564 (1969)]. Az „A” antigénről úgy gondolják, hogy 54K és 70K molekulasúlyok közti tartományban levő glikoproteinekből áll [j. Gen. Virol. 64, 2597-2610 (1983)1 A különböző CVI-988 MDV-tételeknek, amelyeket „A” antigén jelenlétére vizsgáltak, sejttenyészetpasszálási történetét összevontan a következőképpen jelöljük: - MDV CVI-988 CEF37 (DEF,.,,- CEF/DEFs_14. cef)5 37). - MDV CVI-988 CEF65 „C” klón (DEFU51 CEF/ DEF52.57- CEFs8_59. DEF/CEF60_65) tarfolt-tisztítási lépések a 39. és 49. passzálás között.- MDV CVI-988 DEF99 „E” klón (DEF,_99. tarfolttisztítási lépések a 87. és 94. passzálások között).- MDV CVI-988 DEF166 (DEF,_166). Az MDV CVI-988 CEF37-et, MDV CVI-988 CEF65 „C” kiónt, MDV CVI-988 DEF99 „E” kiónt és MDV CVI-988 DEFt66-ot vizsgálunk át „A” antigén jelenlétére immunprecipitációs tanulmányok segítségével, MDV-gp 54/70-re irányuló nyúlszérumot alkalmazva amelyet Dr. Velicer, L. (Lansing, MI, USA) volt kedves rendelkezésünkre bocsátani. „A” antigént nem mutatunk ki CVI-988 DEFi66 MDV felülúszó folyadékban, de a 35., 65, és 99. passzázsokkal fertőzött sejttenyészetekben ez termelődött. A sorozatos sejttenyészet-passzálások és tarfolt-tisztítások során a termelt „A” antigén mennyiségének fokozatos csökkenését figyeljük meg. A CVI-988 CEF65 MDV „C” klón által termelt „A” antigén mennyisége durván 90%-kal alatta volt a CVI-988 CEF37 MDV által történő „A” antigén kifejeződésnek. Mivel a találmány szerinti víruskészítményt (CVI-988 CEF65 MDV „C” klón) teljesen legyengítettnek tekinthetjük a nagymértékben fogékony RIR csirkékre való patogenicitás szempontjából, indokolt az a következtetés, hogy az MDV legyengítése nem mindig kapcsolódik össze az „A” antigén kifejeződés teljes elvesztésével. I. PÉLDA A CVI-988 DEF5! MDV „C” klón patogenicitásának meghatározása a RIR csirkék szempontjából, összehasonlítva az FC 126 HVT-vel és CVI-988 CEF,, MDV-vel. A vizsgálatot SPF RIR csirkékkel hajtjuk végre a Houghton Poultry Research Station-ban (Houghton Baromfikutató Állomás, Anglia). A csirkéket módosított Horsfall-Bauer-izolátorokban tartjuk. A madarakat „ad libitum” etetjük forrázott takarmánnyal. Az állatokat naponta megvizsgáljuk 24 héten át MD klinikai tüneteinek előfordulására. A csirkéket egynapos korban inokuláljuk intramuszkulárisan 10000 FFU szóban forgó vírussal 0,5 ml szövettenyésztő közegben, amely a szokásos szabadtéri dózis tízszeresének felel meg. Az összes vakcinakészítmény a vírust sejttel kapcsolt formában tartalmazza. 20 RIR csirkéből álló csoportot inokulálunk CVI-988 CEF35 MDV-vel, a kereskedelmi vakcinával. Egy másik, 20 RIR csirkéből álló csoport a találmány szerinti víruskészítményt kapja (CVI-988 DEF51 MDV „C” klón). 43 RIR csirkéből álló csoportot HVT FC 126-tal inokulálunk. Az elhullt és halódó állatokat kivesszük és boncolásnak vetjük alá. A szöveteket mikroszkóposán vizsgáljuk meg. A megfigyelési periódus végén az összes megmaradt csirkét leöljük és megvizsgáljuk mind makroszkóposán, mind mikroszkóposán. Az idegi elváltozásokat Payne és Biggs szerint osztályozzuk [Journal of the National Cancer Institute, 39,281-302 (1967)], mint gyulladásos (B típusú) elváltozásokat és nyirokduzzanatos (A típusú) elváltozásokat. A megnövekedett limfoid beszűrődést és a limfocitás hiperplasiát a belső szervekben a Marek-kór jeleinek tekintjük. A csirkék teljes számát korrigáljuk a nem fajlagos mortalitás alapján 21 napon belül a kikeltés után. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja be, az MD mikroszkópos patológiai és/vagy mikroszkópi jeleit mutató csirkék számának és a vizsgálatnak alávetett összes csirkék számának a hányadosa formájában. A RIR csirkék inokulálása a kereskedelmi vakcinával (CVI-988 CEF35 MDV): a 8 csirke közül 5-ben paralízist indukál. A paralízis társul a perifériás idegek és a nervus plexi endo-neurális gyulladásával (B típusú elváltozás). További két csirkét veszünk ki, amikor haldokolnak. Ezek a csirkék szintén B típusú elváltozásokat mutatnak a perifériás idegekben. Egy csirke, amely a vizsgálat során hullott el, nem mutatja semmiféle jelét a Marek-kómak. Az első két hétben 12 csirke pusztul el véletlenszerű okokból. Sem makroszkopikus jelek, sem mikroszkópos elváltozások nem láthatók RIR csirkéknek abban a csoportjában, amelyet a találmány szerinti vakcinakészítménnyel inokulálunk. Megfigyelünk viszont paralízist egy RIR csirkében, amelyet HVT FC 126-tal inokuláltunk. A perifériás idegek mikroszkópos vizsgálata kis elváltozásokat tár fel, amelyek endoneurális limfómára jellemzők. A megfigyelési periódus végén a mikroszkópos vizsgálat B típusú elváltozásokat mutat három, HVT FC 126-tal inokulált csirke perifériás idegeiben. A klinikai paralízisben szenvedő egyik csirke nem fajlagos neuritíst mutat. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
