194411. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fagocitasejtek megjelölésére
1 legalább enyhén hidrofil összekötő rész, amely áthidalja a hidrofil rész és a funkcionális aminocsoport közötti szükséges távolságot. A hidrofil tulajdonság nyilvánvalóan azért szükséges, hogy megakadályozza a kettős rétegen belül is kialakuló kapcsolatok létrejöttét és ezáltal biztosítsa az aminnak a felületen túlra történő „kinyújtását”. Példaként említjük a találmány szerinti érti lemben vett, jól funkcionáló „kinyújtott” aminra a 6-amino-mannóz-koleszterin származékokat, például a 6-(5-kolesztén-3-il-oxi) hexil 6-amino-6-deoxi-l-tio-D-manno-piranozidot. Ebben a példában a koleszterin képviseli a hidrofób részt, az amino-mannóz pedig viszonylag hidrofil. Minden bizonnyal más kiviteli alakok is lehetségesek: például egyéb amino-cukrok, melyek más koleszterin-származékokhoz kapcsolódnak ugyanúgy megfelelő alternatív kiviteli alakjai lehetnek a hidrofil, illetve a hidrofób résznek. „Okkult infekciók” olyan fertőzési gócokat jelentenek, melyek a test rejtett helyein találhatók, és melyeket a fizikális vizsgálat során nehéz felfedezni. Az egyszerűség kedvéért a következő - általában konvencionális — rövidítéseket használjuk a továbbiakban. Ezeket — használatuk megkönnyítése érdekében - az alábbiakban soroljuk fel : Kémiai nevek: , DSPC = disztearoil-foszfatidil-kolin, Ch = Koleszterin, AMS = „6-amino-mannóz” = 6-(5-kolesztén-3-il-oxi) hexil 6-amino-6-deoxi-l-tio-D-manno-piranozid, AML = „6-amino-mannit”, az AMS megfelelő redukált formája, . . A23187 = az ionofor, (6S-(2S*3S ,), 8<R*, 9,11/-5-metil-amino-2-3, 9, ll-tri-metil-8-/l-metil-2-oxo-2- (lH-pir rol-2-il)-3,9,l l-etil/-l,7dioxasporo[5,5]undec-. 2-il)-metil/-4-benzoxazol-karbonsav, NTA = nitril-tri-ecetsav, EDTA = etilén-diamin-tetra-ecetsav. Részecskék: t PMN = polimorfonukleáris leukociták, SUV = kis unilamelláris vesiculák. A PBS puffer olyan foszfáttal pufferolt sóoldat, amely 0,9% nátrium-ldoridot tartalmazó 5—10 mM foszfátból áll, meghatározott pH-ra - általában pH 7,4-re pufferolva. Mint már említettük, a találmány tárgya - nagy általánosságban — fagocita sejtek jelölése olyan specifikus, fagocitózisra képes micelluláris részecskék segítségével, melyek az izotóp hordozójaként működnek. A találmányban való felhasználásra különösen előnyösek a foszfolipid vesiculák. Előállításuk és használatuk módját a találmány alábbi előnyös kiviteli alakjának leírásában közöljük. A vesiculák előállítása és feltöltése A találmány szerinti használatra alkalmas, felületire.. kötött aminokat tartalmazó vesiculákat ismert eljárással állítjuk elő, amint azt az itt hivatkozásul említett 4.310.505 számú USA-beli szabadalmi leírás ismerteti. Az alap-vesiculák DSPC-t, L-dipalmitoil-foszfatidil-kolint (DPPC) vagy — kevésbé előnyös esetben — más foszfolipideket, például leticint, továbbá neutrális lipideket, előnyösen koleszterint tartalmaznak. A vesicula előállításakor a médiumba helyezett „kinyújtott amin” előnyösen AMS vagy AML, de más olyan vegyületek is alkalmazhatók, melyek megfelelnek; a „kinyújtott aminokra” vonatkozó, fent felsorolt kritériumoknak. Az egyik jellegzetes 2 készítményben 20 pmol DSPC-t, 7,5 pmol Ch-t, 0,04 pmol A23187-et és 2,5 pmol AMS-t tartalmazó kloroform oldatot párologtatunk száradásig nitrogén alatt, majd egy éjszakán keresztül vákuumban tovább szárítjuk. A keletkező lipid-filmet ezután 0,6 ml PBS pufferrel — melynek pH-ja 7,4 és 1 mM EDTA-t tartalmaz - hidráljuk, majd nitrogén alatt 10 perces hangkezelésnek vetjük alá, titánium mikrocsúccsal felszerelt Heat System sonicator segítségével. A készítményt ezután 60^C-on 10 percig lágyítjuk, majd 300 g-vel történő centrifugálással tisztítjuk. Az üledéket eldobjuk, a vesiculákat tartalmazó felülúszót pedig 30x1,5 cm-es Sephadex G-50-es oszlopon történő kromatografálással választjuk el a be nem kebelezett EDTA-tól. Az Ilymódon előállított vesiculák átlagos átmérője 100 Anél kisebb. Az EDTA-n kívül más kelátképző szerek is használhatók. A vesiculák jelölése In-lll-gyel az itt hivatkozásként említett 4.310.506 számú USA-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárással történik. Jellemző módon, az inkubációs keverék 500 pl vesiculát tartalmaz PBS-ben, továbbá 35 pl 3,4 pM InCl3-t 104 mM nátrium-citrátban (pH=7,4) és 1-50 pl In+3 -111-et 2 mM HCl-ben. (Az In+a-111 oldat által okozott higulást azonos térfogatú kétszeres titerű PBS-sel állítjuk helyre.) EDTA-t azért használunk, hogy a be nem kebelezett In*3 -111 segítségével befejeződjék a feltöltés. Eljárás fagocita sejtek izotóppal történő jelölésére Amint korábban már említettük, a találmány egyik előnyös kiviteli módja a fagocita sejtek specifikus izotópos jelölésére vonatkozik, vesiculák — előnyösen kis unilamelláris vesiculák — használatával, melyeknek felületére kinyújtott aminokat inkorporáltunk. A felületükön kinyújtott aminokat tartalmazó vesiculákat „feltöltjük , hogy a fagocita sejtek jelölésére alkalmas anyagot hordozzák, majd összekeverjük őket a jelölendő fagocita sejteket tartalmazó oldattal. A vesiculákban történő inkorporációra alkalmas jelölő anyagok közé tartoznak radioaktív izotópok, előnyösen a y-sugárzók, amilyen például az In-111, a Ga-67, a Tc-99M, aCr-51, az 1-125, továbbá olyan anyagok, amelyek fluoreszkálnak, vagy más módon detektálhatók a fagocita sejtek in vitro alkalmazásakor. A fagocita sejteket adagolhatjuk valamilyen keverékben — például teljes vérben — illetve szükség esetén koncentráltabb formában, például vérplazmában. A vért összekeverhetjük például citrát-dextrózzal vagy pufferolt heparin-oldattal és 25-39 *C-on - előnyösen körülbelül 34-37 6C-on - körülbelül-3 perctől 1 óráig terjedő időtartamig, előnyösen körülbelül 30 percig inkubáljuk. Az így keletkezett izotóppal jelölt fagocitákat ezután, szükség esetén, centrifugálással visszanyerhetjük.__ Ha a minta-oldat tartalmaz nem-fagocita sejteket is, akkor bármilyen nem-specifikus, nem fagocitált Îelölő anyag eltávolítható olymódon, hogy az oldat :oncentrációját 0,5—3 M-ra — előnyösen 1 M-ra — módosítjuk, valamilyen kinyújtott aminban, mely lehet valamilyen más, hasonló tulajdonságú molekula is. Ez a kezelés arra szolgál, hogy bármilyen, a nem-fagocita sejtek felületéhez kötődött és be nem kebelezett vesiculát disszociáljon, az asszociált és disszociált vesiculák közötti egyensúly eltolása révén. Az oldatot ezután centrifugáljuk, a jelölt fagociták visszanyerése érdekében. Az oldott anyagokat és szabad vesiculákat tartalmazó felülúszót eldobjuk. Okkult infekciók felfedezésére szolgáló eljárás 194.411 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
