194318. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta 1-dehidrogénezésére toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyagok jelentlétében
\ 1 Kontroll 24 kb. 3 Kevés degradációs termék 48 kb. 2. Kimutatható szteroidveszteség Kísérleti menadion és 5 nap kb. 2 ~50% szteroidveszfeség kataláz 24 48 kb. 5 kb. 5 5 nap kb. 5 Szteroid degradáció nem mutatható ki. 3. példa a) Száraz sejtek előállítása 6 g/1 glükózt, 6 gjl peptont és 6 g/1 kukoricalekvárt tartalmazó táptalajt (pH 7,0) beoltunk Arthrobacter simplex-szel (ATCC 6946) és a tenyészetet rotációs rázón 28°C-on rázatjuk, míg a glükóz elfogy. Ezután hozzáadunk 0,5 g/1 kortizon-acetátot és a lombikokat további 16 órán át inkubáljuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, vízzel kétszer mossuk és vákuumszárítószekrényben 45eC-on szárítjuk. b) Hidrokortizon prednizolonná alakítása biokonverzióra? A száraz sejteket 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 50 mmól/l-es foszfát-pufferban 0,05 g/1 koncentrációban újraszuszpendáljuk. A szubsztrátot 100 mg/ml koncentrációjú dimetil-formamidos oldat formájában adjuk a szuszpenzióhoz, 0,5 g/1 végkoncentrációban. A menadion 8,6 mg/ml koncentrációjú etanolos oldatából 0,5 ml/100 ml végtérfogat mennyiséget adunk a reakcióelegyhez. Az egyes lombikokban lévő reakcióelegy térfogatát 50 mmól/l-es foszfát-pufferral 100 ml-re egészítjük ki. A katalázt a Sigma Chemical Company-tói szerezhetjük be, az enzimpreparátum aktivitása 2300 egység/mg. Az (A) lombikba 2300 egység katalázt mérünk, a (B) lombik nem tartalmaz enzimet, ez az egyetlen különbség a két lombikban lévő reakcióelegy bén. Az elegyeket 28°C-on inkubáljuk, keverés közben, 23 órás inkubálás után az (A) lombikban lévő hidrokortizonnak kb. 69%-a alakul prednizolonná. Ugyanakkor azonos idő alatt a (B) lombikban a hidrokortizonnal csak kb. 42%-a konvertálódik prednizolonná. Az eredményekből látható, hogy a kataláz-enzlm hozzáadásának hatására kb. 27%-kal növekszik a biokonverziós termék mennyisége. A prednizolont a szokásos módon nyertük ki a reakcióelegyből. Az Arthrobacter simplex helyett Bacterium cyclooxydans ATCC 12673 törzset használva (3 065 146. számú Amerikai Egyesült AHamok-beli szabadalmi leírás) hasonló eredményeket kapunk. 4 4. példa A sejteket az 1. példában leírt módon tenyésztjük. Az aktív sejteket centrifugálással vagy szűréssel összegyűjtük. A nedves sejtmasszát melegítés közben kb. 3-5% nedvességtartalomig szárítjuk. A szárított sejteket 50 mmól/l-es foszfát-pufferban (pH 7,5) újraszuszpendáljuk és 20 percen át keverjük, majd 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 100 ml-enként szét mérj ük. 5 x 10'* mól/1 végkoncentrációban etanolos oldatban lévő menadiont adunk a lombikokba. A lombikok feléhez 10 mg/1 katalázt mérünk, ez kb. 16 000 egység/l-nek felel meg. Az androszt-4,9(1 l)-dién-3,17-diont száraz por formájában 10 g/1 koncentrációban adjuk az elegyhez. A lombikokat rotációs rázón 28°C-on inkubáljuk. A biokonverziós elegyekből vett mintákat metilén-kloriddal éxtraháljuk. A szárított extraktumok gázkromatográfiás analízisével meghatározzuk az átalakulás fokát. 2 Eredmények: Atalakulat-Szárított Sejt típusa Kataláz sejt ekvivalat szubsztrát 26 lens g/1 óra múlva (%) 5 Centrifugált — 38,9 5 Centrifugált ♦ 9,8 Szűrt — 47,4 + 83 7,5 Centrifugált — 24,0 ♦ 93 Szűrt — 393 ♦ 7,2. 10,0 Centrifugált — 9,8 ♦ 9,8 Szűrt — 313 + 7,0 5. példa A szárított A. simplex sejteket 50 mmól/l-es kálium-foszfát-pufferban (pH 7,5) 20 percen át újraszuszpendáljuk, 5 g szárított centrifugált sejt/1 mennyiségben, majd a sejtszuszpenziót 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 100 ml-enként szétmérjük. A menadiont és a katalázt az alábbi táblázatban feltüntetett mennyiségben adjuk a lombikba. A 16/3-metil-androszt4,9( 1 l>dién-3,17-diont mikronizált por formájában adjuk az elegyhez, 15 g/1 koncentrációban. A lombikokat rotációs rázón 31°C-on inkubáljuk. A mintákat metilén-kloriddal extraháljuk. Az extraktumok szteroid-tartalmát gáz-kromatográflás eljárással határozzuk meg. Eredmények: Kataláz koncentrációja mg/1 Menadion koncén tciója mg/1 Átalakulatlan szubsztrát % 19 óra 43 óra 91 óra 2,5 (4000 egység/l) 86 243 12,0 93 2,5 (4000 egység/l) 129 22,1 15,0 12,7 5,0 (8000 egység/l) 86 21,9 93 83 5,0 (8000 egység/l) 129 14,6 4,6 43 6. példa A szárított A. simplex sejteket a 4. példában leírtak szerint újraszuszpendálva két lombikba szétosztjuk. A sejtek végkoncentrációja kb. 1,5 g szárított sqt/l-nek felel meg. Mindkét lombikba 5 mg (8000 egység) katalázt és etanolos oldat formájában 8,6 mg menadiont mérünk. A 16/3-metil-A9 *-androszténdion szubsztrátot száraz por formájában adjuk az elegyhez 20 g/1 koncentrációban. Az egyik lombikba 3 mg/1 koncentrációban szuperoxid-dlszmutázt (Sigma termék S8254, kb. 3000 egység/mg protein aktivitású) mérünk, a másik lombikba nem teszünk szuperoxid-diszmutázt. A lombikokat 31°C-on rotá-194318 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
