194318. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta 1-dehidrogénezésére toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyagok jelentlétében
1 194318 2 hordozó hátrányosan befolyásolja a reakciót. A toxikus oxígénféleségektol mentesítő anyagot előnyösen a reakció kezdetén adjuk a biokonverziós rendszerhez, A mentesítő anyagok vagy azáltal hatnak, hogy eliminálják a káros oxigénféleségeket, vagy ügy csökkentik a káros oxigénféleségek hatását, hogy megtámadják az oxigénféleségeket stabilizáló enzimeket. Káros oxigén féleségek alatt hidrogén•peroxidot, szuperoxid-aniont, hidroxilgyököt, atomos oxigént, stb. értünk. A mentesítő anyag valamely szerves anyag, például kataláz, peroxidáz, szuperoxid-diszmutáz enzim, vagy szervetlen anyag, például platina vagy egyéb fémkatalizátor lehet. Az alkalmazandó mentesítő anyagot és annak előnyös koncentrációját gazdaságossági szempontok szerint választjuk meg. A katalázt kb. 100-10 000 egység/g átalakítandó szteroid koncentrációban használjuk. Egy egység alatt az enzim azon mennyiségét értjük, amely percenként 1 firnól hidrogén-peroxidot bont el pH 7 értéken, 25°C-on, miközben a hiidrogén-peroxid koncentrációja a reakcióelegyben 10,3 jumól/ml-ről 9,2 /rmólfl re csökken. A szteroidok 1-dehidrogénezése során a reakcióelegyet 5—4S°C-on 0-7 napon át inkubáljuk. Az inkubálás alatt a reakcióelegyben előnyösen molekuláris oxigén-felesleget biztosítunk, és az elegyet előnyösen keverjük. Az 1-dehidrogénezés sebessége az idővel jellegzetesen csökken. A biokonverzió 5-60 g/1 szubsztrát-koncentráció alkalmazása mellett 2 napon belül 90—100%-ban végbemehet. A szubsztrát/ sejt arány 2-25 g szubsztrát/g száráz sejt lehet. Szubsztrátként 3-keto-A4 -androszténeket vagy 3-keto-A4-pregnéneket használhatunk a találmány szerinti eljárásban. A szteroid-l-dehidrogenáz enzimnek szubsztrátként azok a szteroidok felelnek meg, amelyek az A- gyűrűn az 1,2-helyzetben telített kötést és az A- gyűrű 3-helyzetében hidroxil- vagy ketocsoportot tartalmaznak. Az androsztén-származékok közül az 1) androszt-4-én-3,17-diont és az 2) androszt-4,9(l l)-dién-3,17-diont, 1 l-hjdroxi-androszt4-én-3,17-diont és ezek 6a-fluor-6a-metll- vagy 16-metil-származékalt; a 3-keto-A4-pregnén-származékok közül a 1) 17a-hidroxi-pregn4-én-20-in-3-ont és 16-metU-szánmazékait, 2) 110,21 -dihidroxi-pregn4,l 7(20)-dién-3-ont és 6a-metíl-származékát, 31 20-klór-pregn4,9(l l),17(20>trién-21-al-2-ont, 4) a 3,20-diketo-A-pregnének néhány csoportját, közöttük a) 11,17,21-trihidroxl-származékokat, például hidrokortizont éis óa-metil-származékát, b) 90,1 10-epoxi-l 7,21-dihidroxi-származékokat, például 90.110-epoxi-17,21 -dihidroxl- 160-metil-pregn4-én-3,10-díont, c) 3,20-diketo4,9(ll)-pregnadiéneket, például 17a,21 -dihidroxi-pregn-4,9(11 )-dién-3,20-diont és lóa-metíl-, 160-metil-, vagy 16a-hidroxi•származékait, illetve 17a-acetát-észterét, d) 3,20-diketo4,9(l l),16-pregnatriéneket, például 2l-hídroxi-pregn4,9(ll),16-trién-3,20-diont és 6a-fluor-származékát használhatjuk. Szubsztrátként használhatjuk a 21-hidroxl-csoportot tartalmazó szteroidok (2. és 4. pontban említett vegyületek) 21-észter-származékait is. A 21-észterek előnyösen rövidszénláncú alkU-, vagy aril-észterek lehetnek, például a rövidszénláncú zsírsavakkal, így ecetsawal, vagy monociklusos karbonsavakkal, így benzoesawal képzett észterek. A biokonverziós eljárás típusa, az enzimkészitmény, szteroid-szubsztrát, elektron-akceptor és peroxid-mentesítő anyag alkalmazandó koncentrációja a dehidrogénező szteroidmolekula tulajdonságaitól függ, melynek megállapítása a szakember feladata. A következőkben általánosságban ismertetjük az 1- dehidrogénezésre használható különféle biokonverziós eljárásokat, amelyeket elektron-hordozó és egy vagy több toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyag jelenlétében hajtunk végre. Fermentációs biokonverzió A megfelelő mértékű sejtszaporodás és szteroid-1-dehidrogenáz aktivitás elérése után a fermentorba beadagoljuk a toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyagot, az elektronhordozót, és a szteroid-szubsztrátot. Az elektron-hordozó hozzáadásának célja a szteroid-l-dehidrogenáz aktivitás fokozása, és a szteroidok bomlásának megakadályozása, vagy a szteroidok olyan nemkívánatos melléktermékekké alakulásának gátlása, amelyek nem igényelnek a szteroid-1- -dehidrogenáz aktivitásához hordozót, A szteroidot és/vagy elektron-hordozót száraz, por, vizes iszap, oldat, vagy vízzel elegyedő oldószerrel — például etanoüal, metanollal, dimetil-formamiddal, dimetil-szulfoxiddal, acetonnal vagy más hasonló oldószerrel - készült sűrű szuszpenzió formájában adagolhatjuk a reakcióelegyhez. A. simplex-szel katalizált fermentációs konverzió esetén elektron-hordozóként előnyösen naftoldnon-származékot, például 2- metíl-l,4-naftokinont használunk, katalitikus mennyiségben. A szteroid-koncentráció 5 és 50 g/1 között változhat. A szubsztrát-koncentráció növelésével növekedni fog a reakció végén átalakulatlanul maradt szubsztrát mennyisége. Az optimális szintet részben a kiindulási anyag azon koncentrációja határozza meg, amely a termékben, mint a következő kémiai lépés kiindulási anyagában még tolerálható. A szteroid-elegy és a fermentlé habzási tulajdonságaitól is függ az optimális szubsztrát-koncentráció. Habzásgátló vagy habtalanító szerek - például disznózsír-olaj, szilikonok vagy polialkilén-glikolok — hozzáadásával szabályozhatjuk a fermentációs elegy habzását és a szteroid szuszpenzióban tartását'. Biokonverzió vizes rendszerben, izolált készítményekkel Az 1-dehidrogenáz aktivitással rendelkező készítményt, a szteroidot, az elektron-hordozót és a mentesítő anyagot 0,01-2 mól/l-es vizes pufferoldatban (pH 6—10) szuszpendáljuk. A reakciókomponensek adagolási sorrendje tetszés szerinti. Az aktív készítmény izolált nedves sejt, száraz sejt, immobillzált sejt vagy sejtmentes enzimrendszer lehet. A sejtekvivalens mennyisége 0,1 g és 50 g szárazsúly/1 között változhat. A szteroidot a sejtekhez viszonyítva kb. 0,05—15 súlyarányban (szteroid/sejt) adhatjuk. A sejt mennyisége 15-50 g/1 szteorid-koncentráció mellett előnyösen 2,0 és 25 g között változhat. A szterold-szubsztrátot száraz por, vizes sűrű szuszpenzió formájában, vagy vízzel elegyedő szerves oldószerben — például dimetil-form amid ban, dimetil-szulfoxidban, etanolban, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
