194318. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta 1-dehidrogénezésére toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyagok jelentlétében
1 A kortikoszteroldokat az 1950-es években kezdték terápiás célra alkalmazni, mégpedig a reuma told arthritis kortizon-acetátos kezelésére. Később kimutatták, hogyha a hidrokortizon Sietve kortlzon 1,2-helyzetében kialakítanak egy telítetlen kötést, a kapott szteroldok - a prednizolon és prednizon - hatása nagyobb, és a gyógyszer által kiváltott sóvisszatartás csökken az alapvegyülethez viszonyítva. Ezt követően a kortikoidokkal kapcsolatos rendellenességek kezelésére alkalmazott szteroldok többségén is elvégezték a fenti 1,2-kettőskötés kialakítást. 1977-ben két olyan Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalom jutott nyilvánosságra, amelyben a kortikoszteroidok-. szterin prekurzoroícból kiinduló szintézisét új oldalról közelítik meg. A 4 035 236. számú Amerikai Egyesült ÁDamok-beli szabadalmi leírásban a 9a-hidroxi-androszténdion előállítását ismertetik szitoszterin, stigmaszterol vagy koleszterin fermentálása útján. A 4 041 055. számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás pedig a gyógyászatiig hasznosítható kortikoszteroidok 9a-hidroxi-androsztén-dlonból történő előállítására vonatkozik, egy általános eljárás segítségével. A fenti átjárások köztltermékei közé tartoznak a 3-keto-A , (* *) konfigurációjú származékok is. A gyógyhatású szteroldok szintézisében fontos köztitermékként hasznosítható szteroidszármazékok A-gyűrűjében az 1,2 telítetlen kötés kialakítására számos mikrobiológiai eljárás ismeretes a szakirodalomból. A 2 837 464. számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint a szteroidok 1-dehidrogénezésére Arthrobacter simplex fermentációs tenyészethez adják a szteroid szubsztrátot. A fenti eljárás használhatósága azonban korlátozott. A fenti baktérium, és más 1-dehidrogénező baktériumok is tovább bonthatják a szteroidmolekulákat, aminek következtében a hozam csökken és nemkívánatos melléktermékek is keletkeznek. A 3 091 575. számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás egy javított eljárást ismertet, amelynek értelmében a szteroldok 1-dehidrogénezését úgy végzik, hogy a szteroidot elektron-hordozóval keverik, és a baktériumsejteket valamely rövidszénláncú alkanollal vagy rövidszénlánéú alkanonnal - például acetonnal - előkezelik. A fenti előkezelés következtében az egyik nemkívánatos enzim — a 20-keto-reduktáz - aktivitása csökken a sejtekben. A 3 047 469. számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírásban más típusú eljárást ismertetnek, közelebbről, a fenti eljárásban az 1,2-helyzetben telített szteroidot egy elektron-hordozó és egy szleroid-l-dehidrogenáz tartalmú extraktum elegyével kezelik, az extraktumot egy Nocardia, Corynebacterium, Mycobaterium vagy Cylindrocarpon nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból nyerik. A fenti módszenei számos olyan hátrány kiküszöbölhető, amely az élő baktériumok alkalmazásából adódik, többek között csökkenthetők a szteroidok lebontásához vezető meOékreakciók. A 3 091 575. számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírásban foglalt eljárás szerint a kívánt termék lebomlását úgy kerülik el, hogy a fermentációs táptalajhoz a szteroid szubsztrát hozzáadása előtt, vagy azzal egyidőben inhibitort - például egy kinon-típusú vegyületet - adnak. Az exogén elektron-hordozók alkalmazását sokszor korlátozza az, hogy ezek mérgezhetik az enzim2 rendszert [J. H. Ouasiel: Methods Ín Enzymology, S. P. Colowick és N. O. Kaplan szerkesztők, Academic Press, Inc., New York, 4. kötet, 329-336, 1957]. Yung és Studebaker [Biotechnology and Bioengineering, 20, 17-25 (1978)] Az elektron-hordozó fenazin-metoszulfát (PMS) szuperoxld- vagy peroxid-képződés miatti lehetséges toxikus hatását vizsgálva Pseudomonas testosteronl szteroid-1-dehidrogenázon, megállapították, hogy a PMS jelenlétében az 1-dehldrogenáz aktivitás lényegében változatlan. Ezt a tényt azzal magyarázták, hogy a fenti erősen aerob mikroorganizmus peroxid-diszmutáz és kataláz aktivitása elegendő ahhoz, hogy a képződő szuperoxidot és peroxidot elbontsa, még mielőtt azok a szteroid-1-dehidrogenáz enzimet károsítanák. A találmány szerinti eljárás olyan elektron-hordozó jelenlétében történő új, tökéletesített 1-dehidrogénezési biokonverzióra vonatkozik, amely a technika állásának ismeretében sem kézenfekvő. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy ha a szteroidok 1-dehidrogenézésére használt mikrobiológiai konverziós rendszerhez valamely beadagolt elektron-hordozó jelenlétében egy vagy több peroxid-mentesítő anyagot vagy szuperoxid-diszmutázokat és peroxid-mentesítő anyagokat adunk, az ismert eljárásoknál sokkal hatékonyabban alakíthatók át az 1,2-telített szteroidok megfelelő 1,2-telítetlen szteroid-származékokká. A fend anyagok hozzadása megakadályozza a sejtek és az elektron-hordozók, vagy a szteroid- 1-dehidrogenáz és az elektron-hordozók kölcsönhatásából származó toxikus oxigénféleségeknek a szteroid-1-dehidrogenáz aktivitására gyakorolt káros hatását. A találmány szerinti eljárás nagyobb hatékonysága abban nyilvánul meg, hogy 1) az 1 g száraz sejt által 1-dehidrogénezett szteroidszubsztrát mennyisége nő, 2) nagyobb szubsztrát-koncentrációt alkalmazhatunk, mint az Ismert eljárások esetén, 3) a biológiai átalakító rendszerben átalakulatlanul maradó szubsztrát mennyisége csökken, 4) az átalakulás sebessége növekszik, 5) csökken a nemkívánatos melléktermékek képződése a biokonverzióban, eltekintve azoktól a termékektől, amelyek a szteroid-lebontó enzimek aktivitásának gátlása céljából az enzim-készítmény specifikus kezelésének következtében képződtek. A fenti hatások összességükben azt eredményezik, hogy a találmány szerinti eljárással a kívánt termék jobb hozammal, ennek folytán gazdaságosabban állítható elő, mint az ismert eljárásokkal. A találmány szerinti eljárást részleteiben az alábbiakban ismertetjük. Mikroorganizmusok Mikroorganizmusként bármely olyan mikróbát használhatunk, amely önmagában ismerten alkalmas a szteroidok 1-dehidrogénezésére. A fenti mikroorganizmusok felsorolása például a [Chamey W. és Herzog, H.: Microbial Transformation of Steroids, Academic Press, Inc., New York, (1967)] irodalmi helyen található. Az Ismert 1-dehidrogénező mikroorganizmusok prokariota vagy eukariota nemzetségbe tartozó különféle fajok lehetnek, példaként az Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces, Bacterium, Pseudomonas, Bacillus, Sep‘tomyxa, Didymella, és Cilindrocarpon nemzetségeket említjük. 194 318 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
