194317. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A40926 antibiotikum komplex és tiszta komponensei, a PA,PB,A,B,BO faktor, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194317 2 vailer módszere szerint végezzük - „Identification of aerobic Actinomycètes of clinical importance”, J. Lab. Clin. Med. 71, 934-944, 1968 -, vékonyrétegkromatográfiás lemezek alkalmazásával, al. L. Staneck és G. D. Roberts által leírt módon) „Simplified approach to identification of aerçbic Actinomycètes by thin-layer chromatography , 28, 226- 231, 1974), a következő oldószer-rendszer alkalmazásával (térf/térf.) : etilacetát : piridin : víz 100 : 35 : 25. A kapott eredmények arra mutatnak, hogy főleg glükóz és ribóz van jelen, és kisebb mennyiségben ugyancsak kimutatható volt a galaktóz, mannóz és a maduróz. Mikolsavak: A mikolsavak jelenlétének kimutatására végzett vizsgálatot Minnikin és munkatársai (D. E. Minnikin, L Alschamaony, M. Goodfellow: „Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin layer chromatography analysis of whole organism methanolysates , J. Gen. Microbiol. 88, 200- 204, 1975), módszere szerint hajtottuk végre. A vizsgálat eredménye negatív: mikolsavak nem találhatók. A törzs azonosítása: A (i törzset az „Actinomycètes, Actinomadura genus rendszertani helyre soroljuk be a következő ismérvek alapján: jelen van a mezo-diaminopimelinsav és a maduróz, nincs jelen a peptidoglukánban a glicin, hiányzik a mikolsav és mérsékelten hosszú spóraláncokat hordozó légmicélium képződik. Más mikroorganizmusokhoz hasonlóan az A 40926 antibiotikumot termelő törzs jellemzői is változásoknak vannak kitéve. Például előállíthatjuk a törzs mesterséges variánsait és mutánsait, különböző ismert mutagénekkel — pl. UV-besugárzással, röntgensugárzással, nagyfrekvenciájú hullámokkal, radioaktív sugárzással -, vegyi anyagokkal - pl. salétromsavval, N-metil-N -nitro-N-nitrozo-guanidinnel - és más módon való kezeléssel. Valamennyi természetes és mesterséges variánst és mutáns, amely az Actinomadura genus speciesei közé tartozik és A 40926 antibiotikumot termel, egyenértékűnek tekintjük az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzzsel és a találmány oltalmi körébe tartozónak jelentjük ki. A találmány szerinti antibiotikumok kinyerését s termelő mikroorganizmus fermentlevéből ismert módon végezzük. Ezek a következőket foglalják magukban: oldószeres extrakció, kicsapás kicsapószerek hozzáadásával vagy az oldat pH-jának megváltoztatásával, megosztásos kromatográfia, fordított fázisú megosztásos kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, affinitáskromatográfia stb. Kitüntetett eljárás az affinitáskromatográfia rögzített D-alanil-D-alaninon, amelyet fordítóit fázisú oszlopkromatográfia követ. A találmány szerinti kinyerési eljárás szempontjából megfelelő rögzített D-alanil-D-alanin mátrixokat ismertet a 83112555 sz. európai szabadalmi bejelentés. A jelen eljárás esetében a kitüntetett matrix a meghatározott pórusméretű keresztkötéses polidextránnal kapcsolt D-alanil-D-alanin. A fermentlé közvetlenül szűrés után vagy előzetes tisztítási eljárás után vethető alá affinitáskromatográfiának. Az utóbbi esetben a teljes fermentációs közeget meglúgositjuk - a pH-t előnyösen 8,5 és 10,5 közé állítjuk be - a mlcéliumon adszorbeálódott antibiotikum oldatba vitelére, majd a fermentlevet szűrjük. A tiszta szürlet pH-ját 2,5-4,5-re állítjuk be és ismét szűrjük, szűrést elősegítő anyag jelenlétében. A szürletet elvetjük, míg a kinyert szűrőlepényt vízben szuszpendáljuk, a pH-t lúgosra állítjuk be - előnyösen 8 és 9 közé — , majd szűrjük a szuszpenziót. A szűrőlepényt ugyanilyen módon kezeljük, az A 40926 antibiotikumot tartalmazó szürleteket pedig összegyűjtjük. Ezeket a szürleteket vagy a szűrt fermentleveket ezután rögzített D-alanil-D-alaninon - oszlopban vagy szakaszosan — affinitáskromatográfiának vetjük alá. Az antibiotikumnak az affinitást mutató mátrixhoz való kötését előnyösen kb. 7,0-8,0 pH-n végezzük és eluálását magasabb pH értékeken (előnyösen 9,0 és 10,5 között) végezzük, vizes bázis segítségével. Ez a vizes bázis lehet ammónia, egy illékony amin, egy alkáli- vagy alkálifém-hidroxid vagy egy lúgos pufferoldat, adott esetben egy poláris szerves oldószer — p. a következőkben meghatározandó poláris vízzel elegyedő oldószer - jelenlétében. A szennyezéseket úgy távolítjuk el, hogy az oszlopot pH 4-8 vizes pufferrel öblítjük át, amely adott esetben sókat, karbamidot és/vagy vízzel elegyedő oldószereket tartalmaz. Ezután az A 40926 antibiotikumot az előbbi eluáló elegyekkel eluáljuk. A nyers antibiotikumot előnyösen úgy nyerjük ki, hogy az egyesített, antibiotikumot tartalmazó frakciókból a, vizet egy szerves oldószerrel - amely vízzel minimum azeotróp keverékek képzésére képes — végzett azeotróp desztillálóval eltávolítjuk, majd a keresett termék kicsapására egy kicsapószert adagolunk. A következőket jelöljük meg olyan oldószerek jellegzetes példáiként, amelyek vízzel minimum azeotróp elegyeket képesek alkotni: n-butanol, benzol, toluol, dibutiléter, széntetraklorid, kloroform, ciklohexán, 2,5-dimetíl-furán, hexán és m-xilol; az előnyben részesített oldószer az n-butanol. Példák a kicsapószerekre: petroléter, rövidszénláncú alkil-éterek (pl. etiléter, propiléter és dibutiléter) és rövidszénláncú alkil-ketonok, pl. aceton. Egy másik megoldás szerint az egyesített, antibiotikumot tartalmazó frakciókat kis térfogatra töményítjük be - előnyösen egy, az előbbiekben meghatározott szerves oldószerrel végzett azeotróp desztilláció segítségével — és a kapott vizes oldatot liofilizáljuk. Ha az eluáláshoz alkalmazott vizes bázis nem illékony, kicsapás vagy fagyasztva-szárítás előtt szükségessé válhat a semlegesítés és a koncentrátum sómentesftése. Egy egyszerű sómentesftési eljárás szerint az antibiotikumot tartalmazó vizes oldatot szilanlzált szilikagél oszlopra visszük fel, az oszlopot desztillált vízzel mossuk és poláris, vízzel elegyedő oldószer és víz elegyével eluáljuk. A poláris, vízzel elegyedő oldószerek jellegzetes példái: vízben oldható alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, rövidszénláncú alkinkarbonsavak rövidszénláncú alkilészterei (pl. etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán és dimetilformamid és ezek elegyei. A kitüntetett poláris vízzel elegyedő oldószer az acetonitril . Egy másik megoldás szerint a sómén tesftést úgy hajthatjuk végre^ hogy az antibiotikumoOartalrnaző 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
