194317. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A40926 antibiotikum komplex és tiszta komponensei, a PA,PB,A,B,BO faktor, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 317 2 3. példa Az A 40926 antibiotikum komplex AB faktor tisztítása 750 mg nyers A 40926 antibiotikum komplexet, amelyet lényegében a 2. példa szerinti eljárást követve kaptunk, és amelynek HPLC titere 70%, 400 ml pH 7,5-re beállított vízben oldunk és az oldatot szűrjük. A szürletet ezután affinitáskromatográfiának vetjük alá D-ala-D-ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose oszlopon (50 ml duzzasztott gyanta, ágy-magasság 5 cm). Az oszlopot, amelyet HCl-val pH-7,5-re beállított 0,16%-os beállított 0,16%-os (tömeg/térf.), 2 M NaCl-t tartalmazó ammóniával egyensúlyozunk ki, egymást követően a következő három pufferoldattal fejlesztjük ki : A puffer: HCl-val pH 7,5-re beállított, 2M NaCl-t tartalmazó 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia (2,6 oszlop-töltet térfogat): B puffer: HCl-val pH 9,5-re beállított, 2M NaCl-t tartalmazó 0,16%-os (tömeg/térf) ammónia (16 oszlop-töltet térfogat), C puffer: pH 11,4%-os (tömeg/térf.) vizes ammónia (2,6 oszlop-töltet térfogat). A C puffer az A 40926 antibiotikum AB faktort egy frakcióban oldja le. Ennek az eluált frakciónak a pH-ját 7,0-ra állítjuk be és felvisszük ugyanerre az affinitás-oszlopra, amelyet 10 mM pH 7,0 trisz-HCl pufferrel kezeltünk, az oszlopot a teljes sómentesítésig desztillált vízzel mossuk. Az antibiotikumot ezután 2 oszlop-töltet térfogatnyi pH 11,0-es, 3%-os (tömeg/térf.) vizes ammóniával eluáljuk. Az eluált frakciókat kis térfogatú vizes keverékké töményítjük be, majd fagyasztva szárítjuk. 374 mg tiszta A 40926 antibiotikum AB frakciót kapunk. 4. példa Az A 40926 antibiotikum A és B faktor szétválasztása 3,3 g, a 2. példa szerint előállított A 40926 antibiotikum AB faktort 0,5 liter vízben szuszpendálunk, a szuszpenziót kevertetjük, majd szűrjük. A tiszta szürletet felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (200 g, töltet-magasság 18 cm, szilanizált szilikagél részecskeméret 0,20—0,07 mm szita lyukbőségnek megfelelő, Merck Inc.), amelyet előzetesen A oldatta] hoztunk egyensúlyba (0,001M vizes EDTA-nátriumsó oldat, NaOH-dal pH 6,0-ra állítva, amely 0,25% (tömeg/térf.) NaH2P04-H20-t és 2,5%-os (tömeg/térf.) NaCl-t tartalmaz. Az oszlopot 0%- 40% (térf./térf.) lineáris acetonitril grádiens mellett (A oldatban) eluáljuk: összesen kb. 7 liter térfogattal, kb. 48 óra alatt. Kb. 15,5 ml-es frakciókat szedünk, amelyeket Bac. subtilis-szel végzett biológiai vizsgálatnak vetünk alá és HPLC-vel határozunk meg. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat összeöntjük. A 310-350. és a 348-365. sz. frakció tartalmazza az A 40926 antibiotikum A faktornak, illetőleg A 40926 antibiotikum B faktornak nevezett anyagokat. Az A 40926 antibiotikum A faktort, illetőleg az A 40926 antibiotikum B faktort tartalmazó összeöntött frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük, az acetonitril eltávolítására, vízzel hígítjuk (kb. a kiindulási oldat-térfogat kétszeresére) és az előbbiekben leírt típusú szilanizált szilikagél oszlopra visszük fel (a duzzasztott matrix térfogata: 50 ml, töltet magasság 15 cm). Az oszlopot a teljes sómentesitésig ionmentesített vízzel mossuk és végül 60 :40 acetonitril : víz eleggyel fejlesztjük ki. Az eluált frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük és a maradékot fagyasztva szárítjuk. Az eluált frakciók első csoportjából (az előbbi 310- 330. frakció) 134 mg A 40926 antibiotikum A faktort, míg az eluált frakciók második csoportjából (az előbbi 348-365. frakció) 206 mg A 40926 antibiotikum B faktort kapunk. 5. példa Az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor elkülönítése Lényegében először a 2.A) példa szerinti eljárást, majd a 2.B) példa első lépését követve a gyantához kötött antibiotikumot 2x20 liter 1%-os (tömeg/térf.) ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumok pH-ját kénsavval 7,8-re állítjuk be és vákuumban n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be. A kapott vizes koncentrátumokat papíron szüljük. A kapott szürlet az A 40926 antibiotikum PA faktort, az A 40926 antibiotikum PB faktort és kisebb mennyiségben az A 40926 antibiotikum A faktort és B faktort tartalmazza (HPLC). Ebből a vizes koncentrátumból egy 10 ml térfogatú mintát - amely kb. 50 mg/ml tiszta A 40926 antibiotikum komplexet tartalmaz (HPLC) — 5 mikron pórusnagyságú szűrőn szűrünk (Acrodisc®, Gelman Science Inc.), majd felvisszük a szürletet egy saválló acél oszlopra (átmérő 2 cm), amely 20 g oktadecil-szilil-szilikagélt (Lichrisorb RP 18, Merck Inc., részecskenagyság 10 jum) tartalmaz, fordított fázisban. A szilikagélt ezután mérsékelt nyomáson (névleges nyomás kb. 14 bar) betöltjük a Chromatospac Modulprep készülék (Yoben Yvon, Franciaország) saválló acél oszlopába és 25 : 75 (térf./térf.) arányú acetonitril: pH 6,10 18 mM nátriumfoszfát puffer elegyével kiegyensúlyozzuk. Az eluálást ugyanazzal az oldószereleggyel végezzük, amelyet az ekvflibráláshoz felhasználtunk, áramlási sebesség kb. 10,5 ml/perc. Az eluátumot Bac. subtilis-szel végzett biológiai vizsgálattal és HPLC technikával elemezzük meg. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat egyesítjük és a kromatográfiás futtatás homogén frakcióját a szerves oldószer ledesztillálásával betöményítjük. A kapott oldatot IM vizes nátriumklorid oldattal az eredeti térfogat kétszeresére hígítjuk és felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (50 g, töltet-magasság 5 cm, szilanizált szilikagél 60, Merck Inc.), amelyet vízzel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot a teljes sómentesítésig (vizes AgN03 hozzáadása után nem keletkezik AgCl csapadék az eluátumokban (ionmentesített vízzel mossuk, majd 1 : 1 acetonitril : víz eleggyel eluáljuk. Az azonos antibiotikumokat tartalmazó eluátum-frakciókat HPLC elemzés szerint összeöntjük, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra betöményítjük és a kapott vizes fázist fagyasztva szárítjuk. Kitermelés: A 40926 antibiotikum PA faktor: 55 mg A 40926 antibiotikum PB faktor: 51 mg A 40926 antibiotikum A faktor: 38 mg A 40926 antibiotikum Bq faktor: 33 mg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
