194317. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A40926 antibiotikum komplex és tiszta komponensei, a PA,PB,A,B,BO faktor, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 317 2 A találmány tárgya eljárás új, A 40926 komplexnek elnevezett antibiotikum ás összetevői, az A 40926 antibiotikum A faktor, az A 40926 antibiotikum B faktor, az A 40926 antibiotikum BQ faktor, az A 40926 antibiotikum PA faktor és az X 40926 antibiotikum PB faktor előállítására - oly módon, hogy az új Actinomadura sp. ATCC 39727 törzset vagy annak egy A 40926-ot termelő mutánsát vagy variánsát tenyésztjük, A találmány tárgya továbbá az említett antibiotikumot hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása. A találmány szerinti antibiotikumok glikopeptid típusúak és az antibiotikumok vankomicin csoportjába sorolhatók, amelyekre az acfl-D-alanil-D-alanin iránt megnyilvánuló kötő kapacitás jellemző, Az A 40926 antibiotikum komplex és összetevői, az A 40926 antibiotikum A faktor, B faktor, Bn faktor, PA faktor és PB faktor sókat képezhet; a sók ismert eljárások szerint állíthatók elő. A leírásban és az igénypontokban az „A 40926 antibiotikum ’ kifejezés a következő vegyületek valamelyikét jelenti: A 40926 antibiotikum komplex, A 40926 antibiotikum A faktor, A 40926 antibiotikum B faktor, A 40926 antibiotikum Bß faktor, a 40926 antibiotikum PA faktor, A 40926 antibiotikum PB faktor, ezek egy sója vagy valamilyen keveréke. Az „A 40926 antibiotikujp komplex , „A 40926 antibiotikurß PA faktor , „A 40926 antibioti^pm PB faktor , „A 40926 antibiotikum A faktor , „A 40926 antibiotikum B faktor”, „A 40926 antibiotikum Bg faktor’ kifejezés, ha a biológiai tulajdonságokról beszélünk, magában foglalja a megfelelő, gyógyászati szempontból elfogadható sókat is. Az A 40926 antibiotikumot egy talajból izolált Actinomadura törzzsel végzett fermentációval állítjuk elő: a törzset 1984. június 8-án egy nemzetközileg elismert gyűjteményben, az American Type Culture Collection-ben (ATCC, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok (helyeztük letébe, a Budapesti Szerződés szerint. A törzset a letétbe helyezéskor az ATCC 39727 hivatkozási számmal látták el. Eredetileg azt gondoltuk, hogy a termelő törzs a Streptomyces genushoz tartozik, ezért kezdetben Streptomyce8 nov. spec. A 40926 jelöléssel láttuk el és így helyeztük letétbe az ATCC-ben, ahol azt az ATCC 39727 hivatkozási számmal látták el. További vizsgálatok - különösen azok, amelyek a sejtfal összetételére irányultak - arra a következtetésre indítottak bennünket, hogy az új törzs az Actinomadura genushoz tartozik. Ennek megfelelően az eredetileg Streptomyces sp. ATCC 39727-ként letétbe helyezett törzset Actinomadura sp. ATCC 39727 törzsként neveztük el. Az A 40926 antibiotikum komplex, az A 40926 antibiotikum A faktor, B faktor, Bq faktor, PA faktor, vagy PB faktor előállítása úgy történik, hogy egy annak termelésére képes Actinomadura sp. törzset - azaz az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzset vagy ennek egy A 40926 antibiotikumot termelő variánsát vagy mutánsát - aerób körülmények között vizes táptalajban - amely asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat ét szervetlen sókat tartalmaz - tenyésztjük. A fermentációt Iparban rendszerint alkalmazott táptalajok közül sok felhasználható, egyes táptalajokat azonban előnyben részesítünk. Kitüntetett szénforrás a glükóz, gaiaktóz, keményítő, kukoricaliszt stb. Kitüntetett nitrogénforrás az ammónia, a nitrátok, szójaliszt, pepton, húskivonat, élesztőkivonat, tripton, aminosavak stb. A táptalajban alkalmazható szervetlen sók azonosak azokkal a szokásosan alkalmazott oldható sokkal, amelyek képesek nátrium, kálium, vas, cink, kobalt, magnézium, kalcium, ammónium, klorid, karbonát, szulfát, foszfát, nitrát stb. ionok szolgáltatására. Az antibiotikum-termelő törzset rendszerint rázólombikban előtenyésztjük, majd a tenyészetet üvegfermentorok beoltására használjuk fel, jelentősebb mennyiségű antibiotikum előállítására. Az elő-tenyésztéshez használt táptalaj azonos lehet azzal, amelyet nagyobb méretű fermentációkhoz alkalmazunk, de más táptalajok szintén alkalmazhatók. Az A 40926 antibiotikumot termelő törzs 20 és 40°C közötti hőmérsékleten, előnyösen 24 és 35°C között tenyészthető. A fermentáció alatt az antibiotikum termelést oly módon követhetjük, hogy pl. biológiai vizsgálatokkal vagy fékonyrétegkromatográfiásan (TCL) vagy nagynyomású folyadék kromatográfiásan (HPLC) meghatározzuk a fermentlé-minták vagy a micélium kivonat minták 'antibiotikus aktivitását. A vizsgálati organizmusként az A 40926 antibiotikumokra érzékeny organizmusokat használhatunk fel, amilyen a Bacillus subtilis és a Streptococcus aureus. A biológiai meghatározást előnyösen agardiffúziós módszerrel végezzük, agar lemezeken. A maximális antibiotikum termelés általában a fermentáció 2. és 5. napja között következik be. Az A 40926 antibiotikumot az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzs - vagy ennek egy A 40926- antibiotikumot termelő mutánsa vagy variánsa - tenyésztésével állítjuk elő. Az antibiotikum fő tömegében a fermentlében fordul elő. Az A 40926 antibiotikumot termelő Actinomadura sp. ATCC 39727 törzs jellemzését a következőkben adjuk meg: Makroszkópos és mikroszkópos vizsgálat A vegetatív micélium hajlékony, elágazó hifákból áll (átmérő kb. 0,8 jum), amely egyes táptalajokon — ezeket az I. Táblázatban csillaggal jelöljük - több napi növekedés után enyhe tendenciát mutat a pálcaalakú elemekké való fragmentálásra, míg glükóz-,, -aszparagin táptalajon kokkoid elemekké fragmentál. Erre a törzsre egyes táptalajokon a vegetatív micélium borvörös színe jellemző. A légmicélium csak néhány táptalajon van jelen. Közelebbről: az I. Táblázatban feltüntetettek közül csak zabliszt agaron és talaj agaron képződik. Ezeken a táptalajokon a légmicélium fehéres-szürke és spórahordozókat képez - amelyek sarló alakban rendeződnek el —, valamint rövid, kb. 10—20 spórából álló spirálokat. A spórák hengeresek és átlagos méretük 0,8 x 1,2 Mm. A növekedési jellemzők meghatározása A tenyésztési jellemzők meghatározásához az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzset különböző, Shirling és Gottlieb által javasolt standard táptalajokon tenyésztjük (E. B. Shirling, D. Gottlieb, Method for characterization of Streptomyces species, Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340, 1966), és ezek mellett néhány, Waksman által ajánlott közeget Is felhasználunk (S. A. Waksman, The Actinomycètes, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Vol. 2, 328-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
