194316. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-2 emberi leukocita interferon előállítására
194 316 2 1. példa A Pseudomonas VG-84 sp. törzset 28°C hőmérsékleten, 12 órán keresztül, a következő összetételű ferde agar táptalajon tenyésztjük: trípton élcsztőextraktum adenin glükóz sztreptomJcin tetraciklin 10g/l 5g/I 80 mg/1 10g/l 150 mg/1 50 mg/1 agar-agar 1 5 g/1 Inokulum készítésére ferde felületű táptalajon tenyésztett biomasszát használunk fel. Ehhez a sejteket egy 750 ml-es Erlenmeyer-lombikban készített, fentebb megadott összetételű 100 ml táptalajra (agar nélkül) tesszük. A sejttermelés 6 óra alatt, 28 C hőmérsékleten, rázóasztalon erős rázással (240 ford/min) történik. Az oltótenyészet optikai sűrűsége 2 optikai egység. A sejttemielés olyan fermentorban történik, amelyet hőmérséklet-, pH-, rázási sebesség- és átlevegőztetési sebességszabályozóval, valamint az olddott oxigén parciális nyomásának mérésére szolgáló berendezéssel látunk el. 5% oldótenyészetet teszünk a már előzőleg megadott összetételű (agar nélküli) tápoldatot tartalmazó fermentorba és a kultúra tenyésztést 6 óra alatt 28 ± 0,5°C hőmérsékleten, 6,7-6.9 pH értéken állandó, intenzív átlevegőztetés és keverés közben végezzük. Az átlevegőztetési és a keverési körülményeket úgy választjuk meg, hogy a kultúra növekedését az oldott oxigén koncentrációja ne korlátozza, ezért az oxigén parciális-nyomását állandó értéken a telítési érték 5—10%-án tartjuk. A pH-érték stabilizására vizes ammónia oldatot alkalmazunk. A biomassza szaporodását a tenyészoldat optikai sűrűségének óránkénti mérésével ellenőrizzük. A fermentációt akkor fejezzük be, amikor az AS50 optikai sűrűség az 5 optikai egységet eléri. A fermentáció befejezése után 1 liter tenyészoldatban 1,5 x 1010 aktivitás egységnyi alfa-2 emberi leukocita interferon van. Az előállított interferon koncentrációjának meghatározásához a radioimmunológiai analízis szilárd testekre alkalmazott módosítását alkalmazzuk. Ebben a vizsgálatban poliklonális nyúl antiinterferon-antitestet és 125-jód-dal jelzett monoklonális egér antitestet alkalmazunk, valamint meghatározzuk az interferon vírusölő hatását. Ehhez megvizsgáljuk, hogy az interferon a diploid emberi fibroplaszt kultúrán milyen mértékű védőhatást fejt ki a vcsikularis stomatitis vírus citopatikus hatásával szemben. Referencia készítményként a MRC 69/19 — angol szabvány szerinti interferont használunk. Interferon forrásként a fermentáció után centrifugálással összegyűjtött sejteket alkalmazzuk. A sejteket 7,5 pH értékű és 0,1 mól/l-es tris-pufferban (5-10 ml pufferba 1 g sejt) szuszpendáljuk és ultrahangos dezintegrátorral összezúzzuk. A sejtdarabokat 30 000 g-nél végzett centrifugálással elválasztjuk a homogén alfa-2-embcri leukocita interferont. Tisztítással előállítjuk az alfa-2-emberi leukocita interferon elektroforetikusan homogén készítményét, amely 210-szeres tisztasági fokú és amelynek specifi- 5 kus aktivitása 4,0 x 10* aktivitási egység, a kitermelés 41%. Az alfa-2 emberi leukocita interferon elekroforetikus adatait az 1. ábra közli. Az ábrán a B jelentése a tisztítás utáni készítmény, jobb oldalon pedig kD-ban kifejezett számok jelölik a standardfehérje molekulatömegét (az elektroforézis 12,5%-os 10 poli(akril-amid)gélben történő nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében). A specifikus aktivitás, a molekulatömeg (18,4 kD), az aminosav-összetevők és egyéb ismérvek alapján az elválasztott alfa-2 emberi leukocita interferon .. , nem különbözik az egyéb baktérium-jellegű termelőtörzsekből izolált alfa-2-emberi leukocita interferontól. 2. példa Az eljárást az 1. példa alapján végezzük. A terme- 20 lőtörzset antibiotikum jelenlétében, mégpedig 50 mg/1 sztreptomicin és 30 mg/1 tetraciklin jelenlétében tenyésztjük. Hat óra fermentálási idő után a baktériumos szuszpenzió optikai sűrűsége 4,2 optikai egység és 1 liter tenyészoldatban az alfa-2-emberi leukocita interferontartalom 7,5xl09 aktivitási egy- 25 ség. 3. példa Az eljárást az 1. példa szerint végezzük. A termelő-30 törzset 50 mg/1 tetraciklin antibiotikum jelenlétében tenyésztjük. 5,5 órás fermentálási idő után a baktériumos szuszpenzió optikai sűrűsége 5,5 optikai egység és 1 liter tenyészoldatban az interferon koncentrációja 9,5 x 109 aktivitási egység. 35 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás alfa-2-emberi leukocita interferon 40 előállítására, amikoris alfa-2-emberi leukocita interferon gént integráló plazmidot tartalmazó termelőtörzset szén-, nitrogénforrást, ásványisókat és biosz-anyagot tartalmazó táptalajon, levegőztetéssel, antibiotikum jelenlétében süllyesztett tenyésztésnek vetjük alá, majd ezt követően a végterméket 45 izoláljuk és tisztítjuk, azzal j ellemezve, hogy termelőtörzsként pVG3 plazmidot tartalmazó Pseudomonas VG-84 speciest alkalmazunk, amelyet az Össz-szövetségi Antibotikum Kutató Intézet kultúragyűjteményében 1742 letéti számon helyeztünk letétbe, és a termelő törzs tenyésztését antibiotikum, azaz sztreptomicin vagy tetraciklin vagy ezek keverékének jelenlétében végezzük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a tetraciklint 30-50 mg/1 és a sztreptomicint 50-150 mg/1 koncentrációban alkalee mázzuk. 1 db rajz Kiadja:Országos Találmányi Hivatal Felelős kiadó: Himer Zoltán KODEX 4
