194314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-glükozidáz gátló új pszeudooligoszacharidok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 314 2 előnyösen úgy járunk el, hogy alkalmas gyantához például pollszdrol bázisú gyantához adszorbeáltatjuk az inhibitorokat a tenyészléból, majd később alkalmas puffer-oldattal, így például foszfát- vagy nátrium-acetát-pufferrel, vagy adott esetben vizet tartalmazó szerves oldószerrel (metanol, etanol, aceton, előnyösen vizes izopropanol) eluálva izoláljuk. Az inhibitort tartalmazó eluátumokat ismert módon ultraszűréssel töményítjük, egyidejűleg sómentesítjük. Az inhibitorok vizes, ionokban szegény oldatát ioncserélő gyantával töltött oszlopon ismert módon szétválasztjuk komponenseire. Gyantaként előnyösen erősen vagy gyengén savas kationcserélő gyantát, például sztirol-divinilbenzol-kopolimer bázisút alkalmazunk, amely funkcionális csoportként -SOjH vagy -COOH csoportokat tartalmaz (Dowex 50 W) (Amerllte CG 120), vagy módosított szulfopropil-bázisút (SP Sephadex), de a kereskedelmi forgalomban lévő számos ioncserélő gyanta szintén alkalmas. A kinyerés utolsó lépése a molekulaszűrő, például poliakrflamid-gél bázisú molekulaszűrő (Biogel P-6) vagy módosított cellulóz bázisú molekulaszűrő (Biogel P-6) vagy módosított cellulóz bázisú molekulaszűrő (Sephadex) alkalmazása. így a tisztított anyag vizes oldatát kapjuk, amelyet például llofilizálással szárítunk. A fajlagos aktivitás 1 mg szilárd termékre vonatkoztatva 4x104 a-amilázinhibitor egység. A fentiekben leírt eljárás szerint kapott anyag lényegében mentes ugyan a szennyeződésektől, de nem kell kémiailag egyneműnek lennie. Ismételten végzett ioncserélős kromatográfiával, például SP-Sephadex-en, vagy molekulaszűrővel végzett kromatografáiással, nagynyomású folyadék kromatográfiával (például NH2-csoportokat tartalmazó megfordított fázisú hordozón, így Lichrosorb NH2 -hordozón acetonitril és víz 3 : 1 arányú elegyével végzett), vagy hasonló módszerekkel az egyes fermentálások során kapott termékek a biológiailag hatásos komponensekké szétválaszthatok. A három fő komponenst W46 A, W46 B és W46 C a-amiláz-inhibitornak neveztük el. E három főkomponens mellett még egyéb, enzimgátló hatással rendelkező pszeudooligjszacharidok is előfordulnak. A tiszta inhibitorok színtelen, amorf pszeudooligoszacharidok. Nitrogént tartalmaznak, kémhatásuk enyhén lúgos, például savas pufferrel, így például vizes hangyasav/ccetsav elegyckkel végzett nagyfeszültségű elektroforézisben az inhibitorok a katód irányában vándorolnak. Az új inhibitorok kötött glükózt tartalmaznak, savas hidrolízis esetén glükóz mellett többnyire nitrogén-tartalmú bomlási termékek keletkeznek. További jellemzőjük a redukáló képesség, amelyet — mint ahogy a cukorkémiában szokás - például trifenil-tetrazoUum-ldoriddal (TTC) kimutathatunk. Az irodalomban már több pszeudooligoszacharid jellegű a-glükozidáz-lnhibitort ismertettek (E. Truscheit és társai, Angew. Chem. 93, 738—755. o. (1981), T. Tajiri és társai, Agric. Bioi. Chem. 47, 671-679 (1983), K. Yokose és társai, J. Antibiotics Jó, 1 157-1175 (1983)). A találmány szerint előállítható W46 jelű inhibitorok azonban a redukáló tulajdonságai, valamint az (I) általános képlet révén az összes ismert a-glükozidáz-inhibitortól különböznek, tehát új anyagokról van szó. Az új anyagok kevéssé polárisok, és mikrobiológiai úton jó hozammal állíthatók elő. A találmány szerint előállítható inhibitorok kezelése, a beteges elhízás kezelése és a diétás étrend segítése szempontjából érdekesek. Ugyanezek miatt a tulajdonságok miatt a pszeudooligoszacharidok diagnosztikai célú reagensként is alkalmasak. Keményítőtartalmú élelmiszer mind az emberi, mind az állati szervezetben a vércukorszint növekedését, és így a hasnyálmirigy fokozott inzulintermelését eredményezi. A hlperglikémia oka, hogy a gyomorbél-rendszerben az amüáz és maltáz hatására a keményítő glükózzá bomlik. Cukorbetegeknél a hiperglikémia különösen erős, hosszantartó. A keményítő felvétel utáni alimentáris hiperglikéinia valamint a hiperinzulinémia a találmány szerint előállított amiláz-inhibitorok, főleg a W46 A, B és C inhibitor segítségével csökkenhető. Ez a hatás a dózistól függ. Az új inhibitorok ezért cukorbetegség, előzményei, beteges elhízás és a diétás étrend segítése céljából alkalmazhatók. Az orális beadás előnyös, ajánlatos étkezéskor szedni az 5-500 mg egyszeri dózist, amelyet a beteg súlyától és egyedi szükségleteitől függően kell megállapítani. A dózis indokolt esetekben nagyobb, vagy kisebb is lehet. A találmány szerint előállított amiláz-inhibitorok különösen az orális applikációra alkalmasak. Adagolhatjuk a hatóanyagokat önmagukban, savaddiciós sóik alakjában vagy a szokásos hordozó- és segédanyagokkal készített gyógyászati készítmények formájában. Az is lehet előnyös, hogy az új hatóanyagokat egyéb gyógyszerekkel, például a vércukorszintet csökkentő vagy a lipidszintet csökkentő anyagokkal együtt kombinálva alkalmazzuk. Tekintettel arra, hogy a nagyobb molekulasúlyú szacharidok a gyomor-bél rendszerben egyáltalán nem vagy csak kevéssé szívódnak fel, az új inhibitoroknak nem lehetnek toxikus mellékhatásai. Ennek megfelelően még p. o. igen nagy adag W46 amilázinhibltorral kezelt kísérleti állat esetén sem lehetett semmilyen tünetet észlelni. Az amilázinhibitor farmakológiái hatásának kimutatása céljából éheztetett, hímnemű, 200—250 g testsúlyú Wistar-patkányoknak 1 kg-ra számítva 2 g keményítővel együtt W46 inhibitort (vagy azok keverékét) adtuk be orálisan. Az inhibitor adagolása előtt, alatt és után vett vérminták cukorszintje kimutatja a készítmény hatását. A vércukorszint szabályozásán kívül az új inhibitorok a nyálban lévő a-amiláz enzim gátlására is alkalmasak. Ez az enzim a szájüregben bontja a keményítőt cukorrá, és az ott keletkezett cukor a fogszuvasodást elősegíti. Az új inhibitorok tehát a fogszuvasodás megelőzésére vagy visszaszorítására is alkalmazhatók. Végül a vegyületek biokémiai reagensként és diagnosztikai eszközként alkalmazhatók. Amildz-teszt Egy amilázinhibitor-egység (AIE) definíció szerint az az inhibitor mennyiség, amely rögzített kísérleti körülmények között két ainiláz-egységet (AE) 50%-ig gátolja. Egy amlláz-egység a nemzetközi megállapodás szerint az az enzim mennyiség, amely a keményítőben 1 perc alatt 1 mikroegyenértéknyi glükózkötést bont. A bontott glükózid-kötések mikroegyenértékeit a redukáló cukor mikroegyenértékeiként határozzuk meg, fotometrikusan, dinltroszalidlsawal, majd kalibráló görbe segítségével maltóz-mikromólban fejezzük ki. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
