194312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új policiklusos éter antibiotikumok és ezeket tartalmazó készítmények előállítására
1 194 312 2 Gabonakeményitő 5 Gabonaáztató lé 5 NZamin YTT* 5 Kobaltklorid 3 Kálciumkarbonát 3 0.002 ‘Enzimmel lebontott kazein készítmény kereskedelmi neve, Humko Sheffield Chemical Co., Inc. 2. UK-58,852 fermentációja és izolálása A fenti tenyészetet tartalmazó rázóedény tartalmát 3 1 alábbi összetételű steril táptalajt és 1 ml szilikon habzásgátló anyagot tartalmazó 5 1-es fermentáló edény inokulálására alkalmazzuk. Alkotórész gn Szerelóz 10.0 Gabonakeményítő 20.0 NZ amin YTT 5.0 Búzacsíra 5.0 Kálciumkarbonát 4.0 1 literre kiegészítő vízmennyiség pH 6.9-7.0 A fermentációt 30°C-on, 1700 ford/perc keverés, 1 térf. levegő/1 térf. táptalaj/perc levegőztetés mellett végezzük, amíg (B. subtills ATCC 6633 mikroorganizmussal szembeni lemezpróba alapján) megfelelő aktivita'st nem észlelünk. Ez körülbelül 4-6 napot vesz igénybe. A fermentlé bioaktivitását és a továbbiakban egymást követő kinyerési lépésekben kapott termék bioaktivitását érzékeny Bacillus subtilis ATCC 6633 vagy Staphylococcus aureus ATCC 6538 törzsek alkalmazásává követjük. A fermentlé alkotóelemeit és a kinyert anyagokat szilikagél vékonyrétegkromatográfiás lapok és etilacetát eluens alkalmazásával tettük láthatóvá. A vékonyrétegkromatográfiás lapokat vanilin reagenssel (3 g vanilin 75 ml etanol és 25 ml 85%-os foszforsav) és 80°C-ra való melegítéssel hívtuk elő. Az UK-58,852 antibiotikum narancs vagy piros foltot ad. Más eljárás szerint a vékonyrétegkromatográfiás lapot agar réteggel vonjuk be, ezt S. aureus vagy B. subtilis mikroorganizmussal beoltjuk, amihez 1,0 ml 1%-os 2,3,5-trifenil-2H-tetrazó]iurn kloridot adtunk, és 16 óráig 3?°C-on inkubáljuk. Az antibiotikumot rózsaszín alapon fehér területként hívódik elő. A fermentáció befejeződése után a teljes fermentlevet metil-izobutil-keton segítségével extraháljuk, az oldószert elválasztjuk, bepároljuk és 35 g maradékot kapunk. A maradékot hexánban szuszpendáljuk, és szűrőn, szilikagél oszlopon keresztül leszűrjük. Az adszorbenst hexánnal mossuk, majd kloroformmal, etilacetáttal, és acetonnal eluáljuk. Az aktív komponenst az etilacetátos frakció Ç*0 g) tartalmazza. Ezt a frakciót bepároljuk és a maradékot szflikagélen kromatografáljuk. A terméket heptánból átkristályosítjuk és 80 mg UK-58,852, kívánt, szilárd, fehér antibiotikumot kapunk. 2. példa Aj 1. példa eljárása szerint az alábbi összetételű táptalaj alkalmazásával végzünk fermentációt: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Kobaltklorid 0.002 NZ amin YTT 5 Kálciumkarbonát 3 10 adag (teljes térfogat körülbelül 25 1) Actinoinadura sp. ATCC 39697 fermentáció teljes fermentlevét 1/3 térfogat mennyiségű metil-izobutfl-ketonnal extraháljuk. Az extraktumot vákuumban bepároljuk és 35 g barna olajat kapunk. Ezt 5x100 cm méretű szilikagél G-t (0,2-0,07 mm szemcseméret Woelm) tartalmazó, kloroform-aceton (3 : 1) oldószerrel nedvesített oszlopon kromatografáljuk. Eluensként klorofonn-aceton (3 : 1) oldószerelegyet alkalmazunk, amelynek átfolyási sebessége 10 ml/perc. 10 ml térfogatú frakciókat szedünk. A frakciókat Analtech szflikagél GF vékonyrétegki omatogfáriás lapokon etilacetát eluens alkalmazásával analizáljuk. Az előhívást 3% vanilin etanolos oldat 85% foszforsav (3 : 1) előhívóval 80°C-on végezzük. A kívánt UK-58,852 antibiotikum piros foltként hívódik. Az UK-58,852 antibiotikumot tartalmazó körülbelül 350 ml térfogat) frakciókat egyesítjük és 5 percig 2 g Darco G60 aktív szénnel keverjük. Ezután leszűrjük és vákuumban bepároljuk. A maradék sárga olajat 100 ml kloroformban oldjuk és azonos mennyiségű, foszforsavval 4.0 pH értékűre beállíttott vízzel keverjük. A két fázist elválasztjuk és a kloroformos fázist azonos mennyiségű 5%-os dinátrlumfoszfát pufferrel keverjük, amelynek pH értékét 1 n nátriumhidroxid oldattal 9-re állítjuk be. A fázisokat elválasztjuk, a kloroformos fázist nátriumszulfáton megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradék sárga viszkózus olajat kis mennyiségű heptánban oldjuk, miközben az kristályosodik. A kristályos anyagot leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. 3,5 g UK-58,852 antibiotikum nátrium sót kapunk. O.p.: 182—183°C. Elemanalízis a C5 jHg7018Na képlet alapján: számított: C 61,06, H 8,51, mért: C 60,90, H 8,32. Az UV spektrum csak végabszorpciót mutat. Optikai forgatás: (a)D = +10° (c = 0,5 metanol). IR (KBr) cm'1: 3423, 2966, 2869, 2821, 1613, 1407, 1377, 1361, 1312, 1257, 1238, 1206, 1175, 1160, 1116, 1093, 1064, 1030, 938,969, 938,919,886. Az UK-58,852 antibiotikum szabad sav formáját a nátrium só kloroformos oldatának és egyenlő térfogatú víznek a keverésével állítjuk elő úgy, hogy a víz pH értékét foszforsawal 3,0 értékre állítjuk be. Ezután a fázisokat elválasztjuk és a kloroformos oldatot vákuumban bepároljuk. A szabad sav UK-58,852 antibiotikumot kapjuk meg. Op.: 123—126°C. Az UV spektrum csak végabszorpciót mutat. Optikai forgatás: (a)^ = +40°C (c = 0,5, kloroform). 3. példa Egy 6 in9 térfogatú, 3600 1 alábbi összetételű steril táptalajt tartalmazó fermentort 1 1, az 1. példa eljárása szerint előállított Actinomadura sp. ATCC 39697 inokulummal oltunk be. Fermentációs táptalaj: Alkotórész Alkotórész g/1 szerelóz 10 Szerelóz 10 gabonakeményítő 5 Gabonakeményitő 5 60 kukoricaáztató lé 5 Kukoricaáztató lé 5 kobaltklorid 0.002 I S’
