194311. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új savas policiklusos éter-antibiotikumok előállítására
». 1 194311 2 nak Streptomyces fajok különböző törzsei között. Az N497-34 tenyészetet ezért a Streptomyces en dus Anderson Gottlieb subsp. aureus Tomita, Nakano, Sato, Shirahata, Yoshlda Morlmoto új törzséne,|c tartjuk. Az „American Type Culture Collection - nál deponáltuk ( 123-1 Parklaqn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA) a budapesti egyezség feltételei között 1984. január 10-én, ATCC-39574 nyilvántarts! számon. Az „American Type Culture Collection -nál deponált N497-34 tenyészet állandósága garantált e bejelentés alapján engedélyezett bármely szabadalom hatályos fennállása folyamán, az N497-34 tenyészet e bejelentés folyamán a „Szabadalmak és védjegyek meghatalmazottja által meghatározott személy számára a 35 USC 122 és 37 Ci'3 1,14 név alatt férhető hozzá, és a deponált tenyészet hozzáférhetőségével kapcsolatos összes korlátozás végérvényesen megszűnik a kért szabadalom megadásakor. A találmány szerinti új antibiotikus anyagot, a Streptomyces endus subps. aureus, ATCC-39574 új törzsének fermentálása, a teljes tenyészlének természetes pll-n metil-lzobutflketonnal történő extra- Itálása és az oldat bepárlása útján állítjuk elő. A visszamaradt olajat heptánban szuszpendáljuk és a sarzsot szflikageflel kezeljük. A szilikagél-pogácsát kloroformmal, kloroform/etil-acctát eleggyel, etil-acetáttal és etil-acetát/aceton eleggyel eluáljuk. Bepárlás után az etil-acctátos frakcióban kis mennyiségű nyers CP-63,517 antibiotikumot kapunk, melyet vegyes nátrium/káliumsó alakjában kristályosítunk. A Streptomyces endus subsp. aureus ATCC-39574 24-36°C hőmérsékleten, szubmerziós körülmények között, rázás és levegőztetés közben tenyészthető olyan tápközegekben, melyek szénhidrátforrásokból, mint cukrokból, keményítőből, glicerinből, szerves nitrogénból (kazln-pepton), élesztőkivonatból, növekedési anyagokból, mint gabona oldható anyagaiból, hallisztből, gyapotmag lisztből, nyomelemeket, mint vasat, kobaltot, rezet, cinket tartalmazó ásványi sókból és pufferező anyagokként kalcium-karbonátból vagy foszfátokból ál. Az antibiotikum úgy nyerhető ki, hogy a teljes tenyészlevet különböző szerves oldószerekkel, például n-butanollal, inetfl-izobutil-kétonnal, vagy kloroformmal extraháljuk 4,0 -8,0 pH-tartományban, vagy a micéliumot a tenyésztés befejezése után elválasztjuk, és a micéliumot extraháljuk, a szürletet elöntjük. A kivonatot híg sziruppá pároljuk be, például heptánban oldjuk, és szllikagélen kromatografálva tiszta vegvülctet kapunk. fnokulumot az ATCC-39574 tenyészettel beoltott ferde táptalajok vagy Roux-palackok vegetatív sejtjeinek lekaparása után állítunk elő. A ferde táptalajokon vagy Roux-palackokban történő kezdeti tenyésztésre alkalmas szilárd tápközeg az ATCC 172 számú táptalaj. ATCC172 Alkotórészek Gramm/liter Glükóz 10 Oldható keményítő 20 Elesztőkivonat 5 NZ Amine A* 1 Kalcium-karbonát 1 Desztillált víz 100 ml-ig, pH-beállítás 7,0-re KOH-dal Agár 20 ’Kazein enzimes hidrolizátumának bejegyzett márkaneve, Humko Sheffield Chemical Co., Inc. A ferde táptalajokról nyert vegetatív sejteket 5 használjuk rázólombikok vagy inokulumtartályok beoltására, vagy pedig az inokuium-tartályokat oltjuk be a zárólombikokból. A rázólombikokban maximális növekedés 96-120 óra alatt érhető el, míg az iuokulum-tartályokban a növekedés legelőnyösebb időszaka a 72-96. óra. Az Inokulum-lombikból 10 vagy tartályból származó vegetatív táptalajjal teljesen fertőzésmentes körülmények között fermentort oltunk be és a fermentációt 48-120 óráig folytatjuk. A rázólombikban rázógépen való rázással tartjuk fenn a levegőztetést, a tartályokba pedig steril leve- 15 gőt vezetünk be j - 2 térfogat levegő/térfogat tápközeg/pero ütemben. A rázás (keverés) sebessége a használt rázógép típusától függ, a rázólombikot általában 150-200 ciklus per perc (CPM) és a fermentort 300-1700 fordulat per perc (RPM) sebességgel rázatjuk ill. keverjük. A sterilitásról állandóan 20 gondoskodni kell. A hőmérsékletet 28-36°C között szabályozzuk. A fermentáció folyamán a habzást steril habzásgátlókkal, például finomított szójaolajjal vagy más alkalmas habzásgátlóval akadályozzuk meg, melyet a beoltás után fertőzésmentes körül* mények között adunk a lombikhoz vagy a fermentor- 25 hoz. Rázólombikokat a következő tápközegek egyikével készítünk elő: 30 35 CL13MZ Alkotórészek Glükóz Szójaliszt NZ Amine YTT* Nátrium-szulfát Kobalt-klorid Kalcium-karbonát Víz 1 literig, pH 6,9-7,0 Gramm/liter 20 10 5 0,5 0,002 2 40 45 50 55 60 JDYTT Alkotórészek Cerelóz Kukoricakeményítő Kukoricalekvár NZ Amine YTT* Kobalt-klorid Kalcium-karbonát Gramm/liter 10 5 5 5 0,002 3 Vízi literig,pH6,9-7,0 ’Kazein enzimes hidrolizátumának bejegyzett márkaneve, Humko Sheffield, Co., Inc. 100 ml tápközeget 300 ml-es rázólombikba mérünk be és 120°C-on 9 33.104 Pa nyomáson 30 percig sterflezzük. Lehűlés után a tápközeget beoltjuk agarban levő ATCC 172 táptalajon tenyésztett S. endus subsp. aureus ATCC-39574 kultúra ferde táptalajról nyert vegetatív sejtszuszpenziójával. A lombikokat 28^C-on, 3-4 napig 3,8-5,1 cm kitéréssel és 150-200 CPM-mel forgó rázógépen rázatjuk. Egy lombikot 5 literes fermentáló palack beoltására Használunk, mely utóbbi 3 litert tartalmaz a következő tápközegek egyikéből: CN-2 (alább), vagy CL13MZ vagy JDY TT (fent). 4
