194310. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új TAN-588 antibiotikum alkálifém-, alkáliföldfém-, ammóniumsójának és N-dezacetilezett-származékának előállítására
1 194 310 2 keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 v% nátrium-klorid, kiegészítve 0,5 v% precipitált kalcium-karbonáttal. Az edényeket 24°C hőmérsékleten 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az ilymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 501 térfogatú femientor tartályban lévő 30 1 táptalajra oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05% Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmérsékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei 48 órán át keverteljük. Acinetobacter sp. YK-504 (1FO 14420, FIRM BP 70) szilárd táptalajon tenyésztett törzset, 2 1 térfogatú Sakaguchi edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 v% nátrium-klorid, kiegészítve 0,5 v% précipitait kálcium karbonáttal. Az edényeket 24°C hőmérsékleten 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az Dymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 50 1 térfogatú femientor tartályban lévő 30 1 táptalajra oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05 v%- Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmérsékleten tartjuk, 501/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei 48 órán át kevertetjük. Az Fmpedobacter lactamgenus YK-258 tenyészetből 3 1-t és a Acinetobacter sp. YK-504 tenyészetből 3 1-t egy 200 1 térfogatú femientor tartályban lévő 120 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5) és összetétele a következő: 3 v% dextrin, 1,5 v% nyers szójaliszt, 1,5 v% kukorica sikérliszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátrium-tioszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásgátlóval. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24 C hőmérsékleten tartjuk, 200 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 150 fordulat/perc sebességű keverővei 24 órán át, majd 20°C hőmérsékleten további 42 órán át kevertetjük. A kapott tenyészethez Hyflo Super Cel szűrőközeget adunk és leszűrjük. 100 1 szürletct kapunk, aminek pH-ját 5 re állítjuk be, majd 101 Ambcrlite IRA- 402 (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot vizes mosás után 50 1 2 v9í, vizes nátrium-klorid oldattal eluáljuk. Az cluátum a TAN-588-at 32 ± g/ml koncentrációban tartalmazza. A vizes éluátumot, ami az N-dezacetllezett TAN-588-at tartalmazza 10 1 Dovex 50 W X 2 (ti* típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az cluálást 50 1 vízzel és 0,2 n vizes ammóniával végezzük. Az eluátumokat egyesítjük és 13 1 térfogatúra pároljuk be, majd 2 1 aktívszén lel töltött oszlopon, pH 5 értéken kromatográfiás módszerrel tisztítjuk. Az eluáláshoz 8 v% izobutanolt használunk. A kapott 20 1 éluátumot 1 1 térfogatúra bepároljuk, majd 0,^ 1 10,5-1 mm szltafrakciójú Dowex 50W X 2 (H típus) hordozóval töltött oszlopon ismét kromatografáljuk. Az eluáláshoz 0,2 n vizes ammónia-oldatot használunk. Az aktív hatóanyagot tartalmazó 1,4 1 frakciót aktívszénnel töltött oszlopon kromatográfiás módszenei sótalanítjuk. Az eluátumot bepároljuk, majd acetont adunk hozzá. Az oldatból poralakú anyag válik kJ. A nyers port preparatív folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítjuk, YMC-Pack, ODS, SH-343 típusú kronratográfot alkalmazva (gyártó cég: Yamamura Chemical Laboratories, Japán) és eluálószerként 0,02 mólos (pH 6,3) foszfát-puffért alkalmazva. Az aktív anyagot tartalmazó eluátumokat egyesítjük és aktívszénnel töltött oszlopon kromatográfiás módszerrel sótalanítjuk. Az antibiotikumot tartalmazó éluátumot bepároljuk és liofilizáljuk. A lioíilizált anyaghoz acetont adunk. 50 mg porfonnájű N-dezacetllezctt TAN-588-at kapunk. A kapott anyagot N-dezacetfiezett TAN-588 (A és B típus keveréke) standard mintát alkalmazva azonosítottuk vékonyréteg kromatográfiás bioautográfiás, nagynyomású folyadékkromatográfiás biohlsztiogram, ÍR és NMR spektrumok alapján. IR-spektruin: 3. ábra (felvétel KBr ban) 3450, 3220, 2960, 2900, 1800, 1760, 1740, 1670, 1580, 1420, 1390, 1370, 1310, 1250, 1200, 1120, 1050, 1030, 980, 950, 920, 810, 770, 720,690,610, 540, cm'1. 1 H-NMR-spektrum: 400, MHz, DjO-ban, ppm J (Hz), 2,52(111, m), 2,72(111,m), 2,91(!H,m), 3,08(1 H,m).4.35(1 II,m), 4,56(1 H,rn), 4,80(1 H,m). 7. példa Lysobacter albus sp. nov. YK-422 (IFO 14384, FERMP BP-698) szilárd táptalajon tenyésztett törzset, 2 1 térfogati! Sakaguchi edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 v% nátrium-klorid, kiegészítve 0,5 v% précipitait kálciuin-karbonáttal. Az edényeket 24°C hőmérsékleten 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az ilymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 50 1 térfogatú femientor tartályban lévő 30 1 táptalajra oltjuk át. A táptalaj összetétel a fentivel megegyező, 0,05 v% Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24 u hőmérsékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei 48 órán át kevertetjük. Acinetobacter sp. YK-504 (IFO 14420, FFRM BP-709) szilárd táptalajon tenyésztett törzset, 2 1 térfogatú Sakaguchi edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 v% nátrium-klorid, kiegészítve 0,5 4 precipitált kalcium-karbonáttal. Az edényeket 24°C hőmérsékleten 48 órán át rázatva Inkubáljuk. Az ily módon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 50 1 térfogatú fermentor tartályban lévő 30 1 táptalajra oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05 v% Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmérsékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei 48 órán át kevertetjük. A Lysobacter albus sp. nov. YK-422 tenyészetből 3 1-t és az Acinetobacter sp. YK-504 tenyészetből 3 1-t egy 200 1 térfogatú fermentor tartályban lévő 120 1 táptalajba oltunk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5) és összetétele a következő: 3 v% Jextrin, 1,5 v% nyers szójaliszt, 1,5 v% kukoricasikér liszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátriumtioszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásgátló-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
