194309. lajstromszámú szabadalom • Expressziós vektorok
1 194 30*} 2 Spring Harbor Lab., New York). Tompa végű fragmentumok összekapcsolása 30-40 jug/ml DNS, 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 5 mM MgG2, 5 mM dithiothreitol, 0.25 mM spermjdin, 1 mM ATP, 10 /ig/ml BSA (Sigma, Type V) összetételű pufferben történt. A reakcióelegyhez 4-6 egység T4 indukált polinukleotid ligázt adtunk, és 8-12 órán át 14°C-on inkubáltuk. DNS minták gélelektroforézisét 0,8-2,0%-os agaróz gélekben (Sigma, Type I), horizontális elektroforézis készülékekben a Helling és mti által leírt (1974) módon végeztük. A poliakrilamid gélelektrotorézis —4 és 8%-os, 1 mm vastag, vertikális géleket alkalmazva — a [Maniatis, T., Jeffrey, A. and van de Sange, H. (1975) Chain length determination of small double and single-stranded DNÄ molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry 14, 3787-3794) közölt recept szerint történt. DNS fragmentumok izolálására agaróz és poliakrilamid gélekből Wingerg G., Hammarskjöld, M. (1980) (Isolation of DNA from agarose gels using DEAE-paper. Application to restriction site mapping of adenovirus type 16 DNA. NAR, 8, 253). DEAE papírt alkalmazó módszerét használtuk. BAL31 nukleázzal a DNS fragmentumokat 100 ög/jul végkoncentrációban, 600 mM NaCI, 12 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM EDTA összetételű reakcióelegyben 30°C-on emésztettük. A megkívánt rövidítés mértékétől függően 1,0 /tg DNS-hez 0,4-1,2 egység enzimet adtunk. Minden esetben az adott DNS fragmentummal és a rendelkezésre álló BAL31 enzimpreparátumrnal teszt reakcióz készítettünk, amelyben különböző idejű ínkubálás után vett minták gélelektroforetikus analízisével meghatároztuk a fragmentum megrövidülésének mértékét. Az enzim működését a reakcióelegy fenolos extrakciójával állítottak le és a DNS etanolos kicsapása után a végeket a 3 -végek jelölésére alkalmas reakciókörülmények között Klenow polimerázzal tompa végekre javítottuk [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York). Kompetens sejteket a HB101, C600 és ED8800 baktériumtörzs transzformációjához a Mandel és Higa által közölt [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning Cold Spring Harbor Lab., New York] CaCI2-os eljárással készítettünk. , DNS fragmentumok 5 -végeinek defoszforilálása. végjelölése polinukleotid kinazzal és [7-' 1 2P]ATP-vel és a nukleotid szekvencia meghatározása a Maxam, A. and Gilberg, W. [(1980) Sequencing end-labeled DNA with basespecific chemical cleavages. Meth. Enzymol. 65, 499-560.) által leírt protokol szerint történik. Az expressziós vektorok előállításához használt egyéb módszerek és eljárások alkalmazásakor a Maniatis, T„ Fritsch, E. és Sambrook, J. [(1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York] által leírt útmutatásokat követtük. Az alábbiakban ismertetjük azoknak az ábráknak a magyarázatait, amelyek abraközi szöveggel nincsenek eUátva. 1. ábra A pBB9 plazmid szerkezete a. pBR322 vektor eredetű részt kettős vonal, a Xrif“ 18 DNS-ből származó részt vastag vonal jelzi. A körön belül feltüntettük a legfontosabb géneket, 5 10 15 illetve szabályozó régiókat. A nyilak a restrikciós endonukleázok hasítási helyeit jelzik. Jelötések: amp az ampicillin rezisztenciát biztosító /0-laktamáz gén, tér tetracilclin rezisztencia gén (a BamHI helyre inszertált idegen DNS miatt ez a gén inaktív, . X a lambda eredetű rész a Xrii 18 transzdukáló fágból származó fragmentumon, 16S az rrnB operon érett riboszómális RNS-nek. 23S megfelelő részei, 5S Pi ,2 az rrnB operon promoterei, Tj ,2 az rrnB operon terminátorai, P, PstI, E: EcoRI, H: HindlII, B: BamHI, S: Sáli, Hp: Hpal, pv: PvuII, F: FpsII enzimek hasítóhelyei. 2. ábra: a pBB9A9 plazmid szerkezete Bevonalazottan jelöltük azt a részt, amelyet a pBB9 plazmidból a BAL31 nukleázzal képzett delécióval eltávolítottunk. A jelölések megegyeznek az 1. ábrán leírtakkal. 4. ábra a pBB9-b28 plazmid szerkezete A jelölések megegyeznek az 1. és 2. ábrán használtakkal. A vastag, vonalazott részek a pBB9 plazmidból két lépésben eltávolított régiókat jelölik. 5. ábra A p408-5 plazmid szerkezete 30 A jelölések megegyeznek az eddigiekben használ takkal. 35 40 45 6. ábra Az rrnB és lac operonok részeinek összeépítése a pER plazmi dókban A pER plazmidok kialakításának egyes lépéseit a p419-10 jelzésű plazmidból és a pLBU3 plazmid EcoRI-HindlII „B fragmentumából részletesen felrajzoltuk. A jelölések: Ap : ampicillin rezisztencia gén, Ro: replikácíós origó, Ti és T2: az rrnB operon terminátorai, P2: az rrnB operon promotere, 16S és 5S:az rrnB operon megmaradt részei, A kimetszett részek a deléciók helyét jelölik. A jobb felső ábra a pER plazmidcsaládot ábrázolja, melyek tagjai csak a BAL31 nukleázzal eltávolított szakasz nagyságában térnek el egymástól. (A jel körüli egymásba ágyazott „kapuk’ a különféle deléciókat jelölik.) 7. ábra Az rrnB és lac operon eredetű részek kapcsolódása a pERIII-8-plazmidban 50 Jelzések: ............. AT-gazdag pfe promoter régió az rrnB P2 promoter előtt---------a rác promoter rmB eredetű -35-Ös régiója 55 --------- a rac promoter lac eredetű — 10-es régiója x a transzkripció iniciálé helye-----------a lac eredetű riboszóma kötőhely A Courier betűvel írt szekvencia az rrnB, a dőlt betűvel írt a lac operon eredetű részt jelöli. A lac operáéi tort és az a-peptid első aminósavait megjelöltük a szekvenciában. 6
