194309. lajstromszámú szabadalom • Expressziós vektorok
1 194 309 2 Az in vitro DNS rekombináció módszereivel tetszőleges eredetű és információtartalmú gének juttathatók be baktériumsejtekbe. Az, hogy az idegen DNS stabilan fennmaradjon a sejtben és az abban kódolt információ kifejeződjön, megfelelő hordozó molekulákkal - expressziós vektorokkal biztosítható. Egy fehérjét kódoló gén expressziójakor a baktérium sejt enzimei előbb a transzkripció során a DNS- ről mRNS-t szintetizálnak, majd erről a transzlációban polipeptidet. Mivel a különböző eredetű génekben eltérő azoknak a részeknek a szerkezete, amelyek az előbbi folyamatokban közreműködő enzimek számára jelzésként szolgálnak és azok működését befolyásolják, tetszőleges eredetű gén hatékony expreszsziója egy gazdasejtben azzal biztosítható, hogy a fehérjét kódoló DNS darabot a kiválasztott gazdában hatékony transzkripciót és transzlációt biztosító szignál szekvenciákhoz kapcsoljuk. Tekintettel arra, hogy a gazdasejtben egy idegen fehérje termelése' nagy mennyiségben hátrányos lehet és a sejt vagy a rekombináns molekula elpusztulásához vezethet, célszerű továbbá olyan szabályozó régióval működtetni az idegen gént, amely csak valamely külső beavatkozás hatására ad utasítást a kódolt peptid termelésére. Fentiek értelmében tehát optimális esetben egy E. coli gazdasejttel alkalmazható kifejező vektor a következő tulajdonságokkal rendelkezik: 1. Erős E. coli promoter, amely magas intenzitású transzkripciót biztosít. 2. A génkifejlődés szabályozhatósága a transzkripció szintjén. 3. Megfelelő szerkezetű és elhelyezkedésű riboszómakötőhely, amely a transzláció hatékonyságát és pontosságát biztosítja. A találmányban ismertetett pER expressziós vektorokban ezeket az előnyös tulajdonságokat az E. coli rrn riboszómális RNS operon és a lac operon részeinek összekapcsolásával kialakított hibrid szabályozó régió biztosítja. A baktériumsejtek önfenntartásának és szaporodásának alapvető feltétele ép, működőképes riboszómák jelenléte. A riboszómák jellegzetes fehérje és RNS molekulákból (rRNS) épülnek fel, az rRNS molekulák pontos szekvenciája a génállományban kódolt. Ezen génszakaszok előtt helyezkedik el a DNS átírását, azaz az rRNS — jelen esetben a végső — képződését szabályozó rész. Ez a szintézis sok más funkcióval szemben nem időszakos és nem esetleges, hanem az élet alapfeltétele így az operon nagy hatékonyságú promotert tartalmaz és a keletkező RNS féléletideje lényegesen nagyobb, mint az aktuális igény szerint keletkező peptidekhez tartozó „messenger RNS-eké. (mRNS). Számszerűen a baktériumok génállományának 0,4-0,6%-a az rRNS-t kódoló szakasz, ugyanakkor a rendkívül aktív promóterműködés eredményeként a de novo RNS szintézisnek közel 50%-a rRN$. A jól ismert és sokat alkalmazott lac operon részlet a béta-galaktozidáz enzim egy részét kódolja és ennek képződését szabályozza. A szabályozás Indukálható karakterű, így a gén átírása csak a szubsztrát laktóz, vagy analógja jelenlétében indul meg. Felismerésünk az a meglepő jelenség, hogy a rí boszómális RNS termelés operonja képes arra is, hogy transzlációs lépés beiktatásával peptid molekulák termelését szabályozza, hogy ilyen célra működtetve is megőrzi egyedülállóan előnyös tulajdonságait, végül, hogy az operont kombinálva egy eltérő tulajdonságú szabályozó résszel, a kombinálás során megőrizhető az rRNS operon eTŐs és tartós hatása, e mellett megjeleníthető a kombinációs operon valamely keresett jellege, amilyen pl. a lac operon derepszesszálhatósága, indukálhatósága. A felismerés hasznosíthatóságához meg kellett oldanunk a következő feladatot: Ha az rRNS operonját plazmidba építjük és utóbbival baktériumsejtet transzformálunk, az rRNS képződés olyan intenzitású, ami gátolva egyéb fontos funkciókat letális a sejtekre. Minthogy a plazmidban csak az intenzív szabályozást kívántuk kihasználni, a7, operonból eltávolítottuk a struktúrgén nagy részét, az így lerövidített operont tartalmazó plazmidok illetve utóbbit hordozó baktériumok már korlátlanul fenntarthatók. A találmány szerinti - így konstruált — pER plazmidok és az ezekkel biztosított génexpresszió legfontosabb jellegzetességei az alábbiak:- a beépített idegen gén transzkripcióját az rm és a lac operonok promoter régiójából kialakított hibrid „rác szabályozó régió biztosítja;- a transzkripció az rRNS operon kettős terminátor régióján terminál. Ennek eredménye, hogy az intenzív transzkripció nem okoz zavart a plazmid replikádéban;- a transzkripció eredménye hibrid RNS, ami a beépített idegen génen kívül rrn operonból származó részeket is tartalmaz. Ennek eredménye, hogy az RNS stabilitása megnövekedett, féléletideje nagyobb az átlagosnál;- a transzkripció intenzitása a lac operátoron át szabályozható és lehetőség van a beépített idegen gén átírásának repressziójára vagy índukációjára;- a transzláció eredményeként az idegen gén terméke fúziós fehérjeként szintetizálódik. Ez egyrészt nagyobb stabilitást biztosít, másrészt a fúziós partner (0-gaIaktozidáz N-terminális, ún. a-peptid) könnyen detektálható és mérhető, így a génkifejeződés akár kolóniában, akár kivonatban meghatározható, A pER plazmidok előnyös továbbfejlesztése, ha a lac operon első génjének transzlációs start szignáljait optimális távolságban helyezzük el a transzkripciő iniciációs pontjától, ez teszi ugyanis lehetővé a hatékony transzlációt. A pER plazmidok további előnyös kivitele, ha- méretük kicsi, 2800-4000 bp- ampicillin rezisztenciát biztosító gént tartalmaznak- a kifejezni kívánt idegen gén beépítésére több különböző hasítási helyet tartalmaznak és ezekbe a gén különböző leolvasási fázisban építhető be. A találmány részletes ismertetésére bemutatott vektorkonstrukció eredményeként létrejött pER plazmidok- egyedi Clal, EcoRI, BamHI, BglII, Xbal és Hindii! restrikciós endonukleáz hasítási helyeket tartalmaznak. A Clal és EcoRI restrikciós endonukleázok hasítási helyeire bármelyik, a többibe egy-egy leolvasási fázisba építhető be az idegen gén,- teljes nukleotid szekvenciájuk ismert- replikációjuk ColEl típusú, sejtenként! kópiaszámuk 20-30. A vektorok konstrukciója a következő fontosabb s 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
