194308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására
1 194 308 2 csak abban az esetben van szükség, ha egy hosszabb DNS szakasz, például mesterséges gén szintézise során a genetikai kódszótár flexibilis felhasználása nem engedi meg, hogy a második ciklus után a klónozott és már összekapcsolt két oligonukleotidból álló DNS szakasz felső szála a 3 -végén például ne C nukleotldot (Pstl hasítás esetén, 2. ábra) - hanem G nukleotidot (például: SstI hasítás esetén, 2. ábrával analóg módon) tartalmazzon. A fentiekben vázolt A út hátránya, hogy a már klónozott első oligonukleotídot a rekomblnáns vektorból ki kell hasítani és tiszta formában kell izolálni, ahhoz, hogy az első oligonukleotid a második oligonukleotlddal az eredeti vagy ettől különböző vektorban összekapcsolható és újraklónozható legyen. Ennek a hátránynak a kiküszöbölésére alkalmazható a B út két (B1 és B2) változata. B út Ha az első klónozott oligonukleotid a rekombináns vektor része marad, az első klónozott oligonukleotídnak a második (harmadik, stb.) oUgonufdeotídhoz való kapcsolása és ugyanebben a vektorban történő továbbklónozása két különféle módon valósulhat meg, B1 út Az emdk megoldási lehetőség olyan vektorok konstruálása és alkalmazása, amelyek több, egymáshoz közeli, 3 -túlnyúló véget eredményező, a vektorban csupán egyszer előforduló hasító helyek tartalmaznak azzal az igénnyel, hogy a klónozás után az alkalmazott enzlmatikus lépések a restrikciós helyek felismerő szekvenciáiból egy, vagy legfeljebb két nukleotidot hagynak meg a klónozandó DNS darab közbenső szakaszában (4. ábra). Ez azbnban nem jelent szigorúan korlátozó tényezőt, mert ezek a nukleotidok, a kémiailag szintetizált DNS darab hosszának alkalmas megválasztásával, másrészt a genetikai kódszótár degenerációjának felhasználásával a tervezett DNS darabba flexibilisen beilleszthetők. A 4. ábra mutatja a BI út alkalmazását olyan vektorból kiindulva, amely négy, egymáshoz közeli egyedi restrikciós helyet tartalmaz. A négy hely közül az egyik 5 -túlnyúló véget (BamHI), a másik három (KpnI, SstI, Pstl) pedig 3 -túlnyúló véget eredményez. A ciklusos alkalmazás első lépése (BamHI, KpnI hasítás, stb.) az 1. ábrához hasonlóan történik, s ennek eredményeként olyan rekomblnáns nyerhető, amely a BamHI és KpnI helyek között tartalmazza az első oligonukleotídot. A második lépésben a rekombinánst először KpnI és SstI enzimekkel hasítjuk, s a hasításból származó lineáris vektort a kihasadt kis résztől megtisztítjuk. A következő ollgonukleotidot, amely 3 -végén az SstI hellyel komplementer szekvenciát tartalmaz, a vektor SstI helyéhez Egáljuk. A Egált egyes szálú szakaszt ezután Klenow polimerázzal a négy dezoxlnukleozld 5*-trifoszfát jelenlétében feltöltjük, ugyanakkor a nem Egált, KpnI hasításból ,szárn)azó 3-túlnyúló véget az alkalmazott enzim 3—5 exonukleáz aktivitása [Maniatís T., Fritsch E. F. és Sambrook J. (1982). Molecular Goning, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. 113-116 oldal] eltávolítja. A kapott lineáris vektort T4 DNS Egázzal ismét cirkularizáljuk (blunt-end Bgálás), s olyan módosított vektort kapunk, amely a kiindulási vektor BamHI-KpnI helye között az első oligonukleotídot, a KpnI-SstI helye között a 4 második oUgonukleotidot tartalmazza úgy, hogy két oEgonukleotid összekapcsolódik, s az összekapcsolást szolgáló KpnI helyből csupán egy nukleotid (G) marad meg. A harmadik lépésben először Sstl-el és Pstl-el hasítjuk a vektort N s tisztítás után a Pstl helyhez Egáljuk a harmadik, 3 -végén Pstl hasításra jeBemző szekvenciát tartalmazó egyes szálú oEgonukleotldot. A második lépésnél leírt enzlmatikus reakciók elvégzése után olyan vektort kaphatunk, amely egymáshoz kapcsolva tartalmazza a felhasznált három oEgonukleotidot. Az így összekapcsolt DNS szakasz belsejében a KpnI helyből csak egy (G), az SstI helyből szintén csak egy (G) nukleotid marad fenn, ugyanakkor ezt a szakaszt a kiindulási vektorban is meglévő két szélső (BamHI, Pstl) feUsmerő hely veszi közre. Ezekkel az enzimekkel az összekapcsolt és klónozott DNS szakasz így kihasítható, s a 2. ábrához hasonló módon a további felhasználásnak megfelelő módon kezelhető. B2 út Mivel a B1 út alkalmazása során az elvégezhető ciklusok számát értelemszerűen a különböző egyedi hasítóhelyek száma limitálja, s ez egy ideáHsan konstruált vektor esetén is elvileg korlátozott, célszerű egy olyan klónozórendszert kidolgozni, amelyben a szintetikus ciklusok elvileg korlátlan számban ismételhetők. Azt találtuk, hogy ez megvalósítható egy olyan szintetikus adapter alkalmazásával, amely egyrészt a szintetikus, klónozandó DNS szakasszal való összekapcsolásra, majd az így kapott llgátumnak az alkalmazott klónozó vektorhoz való kapcsolására egyaránt akalmas úgy, hogy ez a szintetikus adapter a rekombinánsokból minden egyes klónozási lépés után azonos módon és maradéktalanul eltávohtható legyen. A fend követelményeknek megfelel egy olyan részlegesen kettős szálú DNS darab, amely két végén egy 3 -, illetve ;egy 5 -túlnyúló egyes szálú szakaszt tartalmaz. Az 5 -túlnyúló vég komplementer a vektornak egy egyedi, 5 -túlnyúló véget eredményező enzim hasítása után kapott végével, míg a 3 -túlnyúló vég egy olyan restrikciós enzimte jeBemző, amely enzimnek megfelelő felismerő hely nem fordul elő a linearizált vektorban. Az adapter kettős szálú szakaszának hossza tág határok között változhat, előnyösen 8—10 bázispár, amely már megfelelő stabl- Etással bíró duplexet eredményez. Az adapter kettős szálú szakaszának hosszát ezenfelül célszerű úgy megválasztani, hogy az alkalmazott vektorral kapcsolatos szelekciós tulajdonság változatlanul érvényesülhessen. így például, ha az adapter egy fúziós fehérjét kódoló DNS szakasz részévé válik a szelekciós lépés folyamán, akkor a szelekció alapjául szolgáló enzimaktivitást ne befolyásolja azáltal, hogy a leolvasási fázist (reading frame) eltolja. Ugyanakkor az adapter nem szabad, hogy a leolvasási fázisban termlnációs triplettet tartalmazzon. À B2 útra alkalmas klónozó vektorral szembeni követelmény elsősorban két egyedi Restrikciós hely megléte. Ezek közül az egyik egy 5 -túlnyúló véget eredményező hely, amely az adapter, flletve az adapter és a klónozandó egyes raálú oligonukleotidból kapott Egátum megfelelő 5-túlnyúló végével konp lementer. A másik ilyen restrikciós hely szintén 5 - túlnyúló véget eredményez, amely az 1. ábrán bemutatott módon, a klónozandó egyes szálú szakasz fel5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
