194306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum bioszintézis befolyásolására in vivo genetikai rekombinációval
1 194 306 2 A prototrófok egy részét Izoláljuk és az 5. példában megadottak szerint vizsgáljuk termelőképességüket. A rekombinációs frekvencia: lxlO"5 3. táblázat A 7-34 trp‘ és a 73 lys~ auxotróf törzsek in vivo DNS rekombinációjával kapott prototrófok antibiotikum termelése: Termelőképesség Törzsek száma (db) % Nem termel antibiotikumot 1 2,9 nebramicin-2 2 5,9 nebramicin-2 és -5* , 16 47,3 nebramicin-2, 4 és -5 15 43,9 A fúziós partnerek mindhárom nebramicin-komponenst termelik. A fúziót és regenerálást követően megfigyeltük, hogy néhány törzs minimal táptalajon, llzin vagy triptofán jelenlétében nem képes növekedni: ugyanakkor gyors növekedést figyeltünk meg lizin és triptofán együttes jelenlétekor. Az eredetileg auxotróf törzsek a rekombinációs események következtében kettős auxotrófokká (trplys") váltak. Tizenhárom kettős auxotróf termelőképességét megvizsgáltuk az 5. példában megadottak szerint, az eredményeket a 4. táblázatban adjuk meg. A kettős auxotrófokból szegregációt követően két prototrófot izoláltunk, ezek antibiotikum termelőképességét szintén megadjuk. 4. táblázat A trp'lys kettős auxotróf és az ezekből izolált szegregánsok antibiotikum termelése Törzs A termelt nebramicin komponens % Str. tenebrarius nebramicin-2 23,1 trp’lys" nebramicin-2 és 4J 7,7 nebramicin-2 és-5’ 30,7 Str. tenebrarius nebramicin-2,4 és -5’ 38,5 prototróf 35 W és 40 W nebramicin4 és -5’ 100,0 A táblázatból kitűnik, hogy az in vivo genetikai rekombinációt követően izolált törzsek termelőképessége lényegesen megváltozott. Különösen érdekes, hogy a kettős auxotrófokból izolált prototrófok elvesztették apramicint bioszintetizáló képességüket, ugyanakkor a termelt antibiotikumok mennyisége a kiindulási törzsekéhez viszonyítva igen nagy. A 7-34 trp" és 73 lys’ 1300-1700 pg/ml közötti mennyiségű nebramicin-2-t, 200( pgtnú nebramicin-4- et és 1040 pg/ml nebramicin-5-t, ugyanakkor a 35 W és 40 W jelű rekombinánsok 104Q(pg/ml nebramidn-4-et és 1950 pg/ml nebramicin-5 -t termelnek. A Streptomyces tenebrarius 35 TL jelű, kizárólag nebramicin-2-t termelő törzset MNG 00243 sorszámon letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében. ej A J1006-3ade' és a J211/2ura' auxotróf törzsek fúziója A Streptomyces tenebrarius J1006-3ade* és J211/2ura" törzseket az MNG 204 sorszámú mikroorganizmusból állítottuk elő mutagén kezeléssel, a törzsek antibiotikumot nem vagy nyomnyi mennyiségben (<5 pg/ml nebramicin-5') termelnek. Az 1. példában megadottak szerint végzett fúziójukat követően 150 prototróf rekombináns termelőképességét vizsgáltuk az 5. példában megadottak szerint. A rekombinációs frekvencia: lxlO'4. A vizsgált törzsek 60%-a (90 db) továbbra sem termelt antibiotikumot, 40%-ul{ (60 db) azonban nebramjcin-4-et és nebramicin-5 -t vagy csak nebramicin-5 -t bioszintetizált. A termelők 13%-a (8 db) 1500 jüg/ml feletti mennyiségben termelt nebramicin-5 -t. Az eredményekből kitűnik, hogy a találmány szerinti eljárással Streptomyces törzsek antibiotikum termelőképessége igen jelentősen fokozható. 3. példa A Streptomyces kanamyceticus leu és arg' auxotróf törzsek fúziója Az 1. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a genetikailag jelzett törzsek tenyésztését addig folytatjuk, míg 3% gücint tartalmazó táptalajon gyenge növekedést tapasztalunk. Az auxotróf törzseket a Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853 jelű törzsből Umezawa és munkatársai, J. Antibiotics. 10A, 181-188, 1957 és a 8695/1961. számú japán szabadalmi közrebocsátás! Irat (Kokai) izoláltuk mutagén kezelést követően. A szülőtörzs kanamicint termel. A leucint igénylő mutáns antibiotikumot nem termel, a minimal táptalajon arginin jelenlétében növekvő mutáns 15 bg/ml kanamicin bioszintézisére képes. A Streptomyces kanamyceticus antibiotikum termelését a 8. példában megadottak szerint ellenőrizzük, azzal a különbséggel, hogy a tenyésztést nem 37°C, hanem 28°C hőmérsékleten végezzük és biológiai értékméréshez Bacillus subtilis tesztorganizmust használunk. A fúziót és a fuzionált protoplasztok regenerálását követően prototrófokat izoláltunk és 144 törzs termelőképességét vizsgáltuk. 12 törzs az ariginin igényes auxotróf termelésénél tízszer több, átlagosan 155 jug/ml kanamicin bioszintézisére képes. A rekombinációs frekvencia: 3x8x10'4 4. példa Intakt, de életképtelen protoplasztok előállítása és felhasználása fúziós partnerként A Streptomyces tenebrarius MNG 169 törzsből és e törzs 404 ura" auxotróf mutánsából protoplasztot készítünk az 1. példában leírt eljárás szerint. A Streptomyces tenebrarius MNG 169 prototróf törzs inaktiválására a belőle képzett protoplaszt-szuszpenzióhoz (10* protoplaszt/ml M jelű tápoldat) dimetflszulfoxidos oldatban, 30®C-on, kannabidiolsav-trietil-aminsót adunk 50-100 pg/ml koncentrációban. 4 órás kezelés után a protoplasztokat centrifugájuk (2300 g, 25 perc), majd a nem reagált inaktiváószer eltávolítására a protoplasztokat M jelű táptalaj_ al mossuk és ismét centrifugáljuk. A prototróf Streptomyces tenebrarius MNG 169-ből képzett, kémiai úton inaktivált protoplasztok és a 404 ura" auxotróf mutánsból készített protoplasztok fúzióját az 1. példa szerint végezzük. A fúzió eredményeit az 5. táblázatban szernléltétjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
