194306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum bioszintézis befolyásolására in vivo genetikai rekombinációval
1 helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Töizsgyűjteményében. A találmány szerinti törzsekkel nebramicin-komponensekct tartalmazó fermentlevek állíthatók elő. A fermentációt előnyösen a 176 103 sorszámú magyar szabadalmi leírás szerint végezzük, az antibiotikumok izolálása pedig célszerűen a 174 315 és 176 103 sorszámú magyar szabadalmi leírások szerint történhet. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint egy Streptomyces kanamyceticus törzset használhatunk rekombinánsok előállítására. A mikroorganizmus tenyésztését, a protoplasztok előállítását, a fúziót és a regenerálást, illetve a kiválasztott törzsek termelőképességének ellenőrzését az előzőekben, illetve a 3. és 8. példában megadottak szerint végezzük. A találmány szerinti eljárás előnyei nyilvánvalóak. Alkalmazásakor olyan,-az antibiotikum(ok) bioszintézisét érintő diploidizációs vagy rekombinációs események játszódnak le, amelyek eredményeként például több antibiotikumot vagy előnyösebb összetételű antibiotikum-keveréket termelő törzsekhez jutunk. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi kiviteli példákkal részletesen szemléltetjük. 1. példa Protoplasztok előállítása, protoplasztok fúziója és regenerálása A Streptomyces tenebrarius MNG 169 és MNG 204 jelű vagy az ezekből készített auxotróf törzsek spóraszuszpenziójával vagy fagyasztott tenyészetével az alábbi összetételű ferdeagarokat oltjuk: dextrin 1,0% élesztőkivonat 0,1% kazein-hidrolizátum (10%-os)* 2,0% húskivonat 0,1% kobalt-diklorid-hexahidrát 0,001% agar 2,5% #Enzimatikusan hidrolizált, A táptalaj pH-ját steiilezés előtt vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121°C hőmérsékleten 20 percen át sterüezzük. Négy napon át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, maid a táptalaj felületéről steril desztillált vízzel leválasztjuk a spórákat. Az így kapott spóraszuszpenzióval az alábbi összetételű steril táptalajt oltjuk: glükóz 1,0% élesztőkivonat 1,0% A táptalaj pH-ját 7,2-re állítjuk be. A tenyészeteket 48 órán át 37°C hőmérsékleten ink ibáljuk, majd e tenyészetek 0,2 ml-évei az alábbi összetételű sterfl táptalajokat oltjuk: glükóz 1,0% élesztőkivonat 1,0% szacharóz 20,5% kalcium-diklorid-dihidrát 03% magnézium-diklorid-hexahidrát 0,6% glicin 4,5 vagy 6%. A táptalajok pH-ját 7,0—7,2-re állítjuk be. A A O A*. UX__A___________ rázógépen Inkubáljuk, majd kiválasztjuk azt a tenyészetet, ahol a glicin növekedésgátló hatása erős, de nerp teljes. Ezzel a tenyészettel ismét beoltjuk a fenti 2 glicint tartalmazó táptalajokat, de a glicin koncentrációkat növeljük. Abban az esetben, ha például a 4% glicint tartalmazó tenyészetet választottuk ki, úgy a továbboltás 5 és 6% glicint tartalmazó táptalajokra történik. Ezután 15 percen át 2300 g-n centrifugálva elkülönítjük a micéliumot, az alábbi összetételű oldattal mossuk és centrifugáljuk: szacharóz 20,5% kalcium-diklorid-dihidrát 03% magnézium-diklorid-hexahidrát 0,6% kálium-klorid 0,0075% Az oldat pH-ja 7,2. Jele: M. A centrifugálást követően kapott micéliumtömeget a fenti oldatban szuszpendáljuk és a szuszpenzióhoz 0,5% Jizozim enzimet (Serva, Feinbiochemica, Heidelberg) adunk. Ezután 37°C hőmérsékleten, enyhe rázás közben inkubáljuk a sejttömeget és 10 percenként mikroszkóp alatt ellenőrizzük a protoplasztok képződését. A micéliumos Streptomyces tenyészet teljes protoplasztolásához 1—4 órás inkubálásra van szükség, törzstől függően. A 100%-osan protoplasztokká alakult tenyészetet ezután centrifugáljuk (2300 g, 25 perc), a fenti M- jelü mosóoldattal mossuk, majd ismét centrifugáljuk. Az üledéket 0,05 ml M oldatban óvatosan szuszpendáljuk, majd regeneráljuk a protoplasztokat. A regenerálandó protoplaszt szuszpenziót 2,5 cm magasságú, gyapotvattából készült tömör szűrőrétegen engedjük át, az esetleg jelenlévő micéliumok eltávolítására. A szürletet megfelelő hígítás után, a hígításokat M oldattal végezve, steril regeneráló alapagarra szélesztjük. Az alapagar összetétele a következő: glükóz 1,0% élesztőkivonat 1,0% szaczaróz 20,5% kalcium-diklorid-dihidrát 0,3% magnézium-diklorid-hexahidrát 0,6% agar 3,0%. Az oldat pH-ja 7,0-7,2. Petri-csészébe öntött 25 ml regeneráló alapagar felületére 0,1 ml protoplaszt szuszpenziót szélesztünk, majd 3 ml regeneráló fedőagarral rétegezzük. A fedőagar összetétele azonos az alapagaréval, de 3% helyett 1,2% agart tartalmaz.' A tenyészeteket 35-37°C hőmérsékleten nedves kamrában inkubáljuk. A harmadik-negyedik napon szabad szemmel megfigyelhetők a regenerálódó telepek. A regeneráló lemezekre juttatott protoplasztok számához viszonyítva a regenerálás gyakorlatilag 100%-os. Ha két auxotróf törzsből készült protoplasztokat fuzionálunk és a hibridek közül csak a prototróf rekombinánsokat kívánjuk regenerálni, úgy az alábbi összetételű minimal táptalajra szélesztünk: diammónium-szulfát 0,5% kálium-dihidrogén-foszfát 0,1% magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05% glükóz 1,0% kalcium-klorid-dihidrát 0,3% magnézium-klorid-hexahldrát 0,6% szacharóz 20,5% Wickerham-vitamin oldat 0,01% agar 3,0% A táptalaj pH-ja 7,2. 194 306 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 4
