194306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum bioszintézis befolyásolására in vivo genetikai rekombinációval
1 194 306 2 A találmány tárgya eljárás amlnoglükozid antibiotikumot bioszintetízáló mikroorganizmusok antibiotikum termelésének minőségi és mennyiség befolyásolására ln vivo genetikai rekombinációval. Részletesebben, a találmány tárgya eljárás amlnoglükozid antibiotikumokat tartalmazó fermentlevek előállítására antibiotikum termelésére képes Streptomyces törzsek in vivo genetikai rekomblnálása és az izolált megváltozott genetikai állományú és megváltozott antibiotikum termelőképességű törzsekkel végzett fermentálás útján. Az amlnoglükozid antibiotikumok csoportjába széleskörűen használt, gyógyászati és ipari szempontból értékes vegyületek tartoznak. Baktériumellenes hatásuk miatt mind a humánterápiában, mind pedig az állatgyógyászatban alkalmazhatók. Ismeretes, hogy a Streptomyces tenebrarius több komponensből álló, nebramicinnek elnevezett antibiotikum-keveréket bioszintetizál (Stark, Hoehn és Knox, Antimircobial Agents and Chemotherapy 1967, 314. oldal, 1 178 489 számú brit, 3 691 279 számú amerikai és 176 103 számú magyar szabadalmi leírások). Umezawa és munkatársai az ATCC 12853 jelű, Streptomyces kanamyceticus törzzsel kanamidnt állítottak elő (J. Antibiotics, 10A, 181 1957. és 8695/1961 számú japán szabadalmi közrebocsátás! irat (Kokai). A kanamicin A, B és C szintén aminoglükozid típusú antibiotikumok. Ismeretes továbbá, hogy a Streptomycetaceae családba tartozó mikroorganizmusok (Streptoinycesek és Micromonospora-k) sejtjei megfelelő körülmények között sejtfal nélküli alakká, protoplasztokká alakíthatók, majd újra normális sejtekké regenerálhatok (Okanishi, Suzuki, és Umezawa, J. Gen. Microbiol., 80, 289, (1973), 4 294 927 sz. Amerikai Egyesült Államok beli szabadalmi leírás). Különböző törzsekből készített protoplasztok fúziójakor genetikai rekombinációs események játszódnak le és új genetikai információkat hordozó sejteket kapunk (pl. Hopwood, Wright és Bibb, Nature, 268, 171 (1977); Alföldi, Szvoboda és munkatársaik 4 294 927 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, (1978); Godfrey, Ford és Huber, Can. J. Microbiol., 24, 994, (1978); Oichi, Hitchcock és Katz, J. Bact., 139, 984, (1979). Ezeket a kísérleteket növekedésükhöz aminosavakat, nukleotid-bázisokat vagy vitaminokat igénylő auxotróf törzsekkel végezték. A genetikai rekombináció tényét úgy bizonyították, hogy például minimál táptalajon uracil jelenlétében növekvő sejtekből készített protoplasztokkal fuzionáltak, majd regenerálást követően aminosavat nem igénylő prototrófokat kerestek (Oichi és munkatársai 1. előbb). A 868 472 és 868 473 számú belga szabadalmi leírásban Baltz és munkatársai Streptomyces protoplasztok előállításának és regenerálásának módszerét, valamint a protoplasztok fúzióját írják le, de nem közölnek antibiotikum bioszintézist befolyásoló eredményeket. Kísérleteiket minden esetben auxotróf partnerekkel végzik. Antibiotikum bioszintézist befolyásoló, protoplasztok fúziójával elért ln vivo genetikai rekombinációs eredményt Streptomyces sejtekkel mindeddig, tudomásunk szerint nem közölt senki az irodalomban. A találmány célja olyan új, az antibiotikumok bioszintézisét minőségi és mennyiségi téren befolyásoló, In viVo genetikai rekombináción alapuló eljárás kidolgozása, amellyel az antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok által bioszintetizált biológiailag aktív vegyületek mennyisége és minősége előnyösen változtatható. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással, protoplasztok fúziójával előállított rekombináns sejtek egy részének antibiotikum bioSzintetizáló képessége meglepő módon, és az összes vizsgált rekombináns törzs számához viszonyítva váratlanul igen nagy arányban, megváltozott. Egyes rekombinánsok más összetételű antibiotikum-komplexet termelnek, mások termelőképessége ugrásszerűen megnőtt vagy csökkent a fúziós partnerekéhez képest. Továbbá azt találtuk, hogy ha a találmány szerint {'árunk el a protoplasztképzés és főként a regenerálás latékonysága igen jelentős mértékben növelhető. Kísérleteink során továbbá arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy a genetikai rekombináció akkor is létrejön, ha fúziós partnerek valamelyikének protoplasztjait kémiai-szerekkel vagy fizikai behatás révén inaktiváljuk. így tehát nincs szükség a fúziós partnerek mindegyikének genetikai markerezésére. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás aminoglükozid antibiotikumokat tartalmazó fermentlevek előállítására antibiotikumok termelésére képes Streptomyces törzsek in vivő genetikai rekombinálása és az izolált, megváltozott genetikai állományú és megváltozott antibiotikum termelőképességű törzsekkel végzett fermentálás útján, amely abban áll, hogy genetikailag jelzett és prototróf vagy genetikailag jelzetlen Streptomyces törzsek sejtjeiből kalcium ionok, magnézium izonok és szacharóz jelenlétében végzett előtenyésztést követően, protoplasztokat készítünk, a genetikailag jelzett törzsekből kapott protoplasztokat, vagy a genetikailag jelzett törzs(ek)ből készített protoplasztokat és a prototróf törzsből vagy törzsekből kapott, de kémiai vagy fizikai módszerekkel inaktívált protoplasztokat fuzionáljuk, az egyesített protoplasztokat regeneráljuk, a megváltozott genetikai állományú törzseket (prototróf, kettős auxotróf vagy szegregáns) izoláljuk, vizsgáljuk antibiotikum termelésüket és a megváltozott antibiotikum termelőképességű törzseket kiválasztjuk, majd az így kapott új törzseket süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, szerves szénás nitrogénforrást, szervetlen sókat, nyomelemeket és állati és/vagy növényi eredetű olajokat és/vagy zsírokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük. A találmány egy előnyös kivitelezési változata szerint növekedésükhöz aminosavakat vagy nukleotidbázisokat igénylő auxotróf törzseket állítunk elő. Az auxotrófok előállítását például mutációkat okozó N-metil-N -nitro-N-nitrozo-guanidines kezeléssel (Davis, J. Am. Chem. Soc., 70 4267, (1948) )végezzük. A kapott auxotrófok antibiotikum termelőképességét és genetikai stabilitását ellenőrizzük. A genetílailag stabil izolátumokat folyékony halmazállapotú, szerves szén- és nitrogénfonást, szacharózt, kalcium- és magnéziumionokat és glicint tartalmazó táptalajon tenyésztjük (a gUcin gátolja a sejtek növekedését). Kiválasztjuk azt a tenyészetet, ahol a glicln-gátlás erőteljes, de nem teljes, a sejteket centrifugálással elkülönítjük, majd mossuk. A mosott sejteket sza5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
